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Application

Anhydrotrypsin Agarose

Application1:Neurotensin(Pyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-lle-Leu)のC末端ペプチドフラグメントのAnhydrotrypsin Agaroseによる単離

Neurotensin自体はカラムに吸着しないが、trypsin消化フラグメントは非吸着画分と吸着画分にそれぞれ分かれて回収された。両者をアミノ酸分析した結果、C末端アミノ酸として、非吸着画分にLeuを有するペプチドが、吸着画分にはArgを有するペプチドが単離されていることがわかった。
比較的短いペプチドから、そのC末端構成ペプチドをAnhydrotrypsin Agaroseカラムで分離する場合、1回のアフィニティークロマトグラフィーだけでほぼ純粋な形に単離できる。高分子量のタンパク質に本法を適用する時は、非吸着画分に回収されたC末端ペプチドフラグメントを逆相系HPLCによってさらに精製する必要がある。
方法
ベッド体積 6.3 ml(0.74φ×14.7 cm); 分画液量 3.0 ml;流速5.0 ml/hr;温度 4℃
(i)Neurotensin(88 nmol)および(ii)Neurotensin(100 nmol)のtrypsin消化物を開始Bufferで平衡化したカラムにかけ、開始Bufferで吸着されなかった画分を除いた後、5 mM塩酸で溶出した。ペプチドの検出はアルカリ性pHにおけるニンヒドリン蛍光法(グアニジノ基特異的)で行った。
結果
アミノ酸分析の結果、非吸着画分にはC末端ペプチドフラグメントであるArg-Pro-Tyr-lle-Leuが、吸着画分にはPyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Argが分離されていることがわかった。またNeurotensinはカラムに吸着されていない。


図4 Neurotensinおよびそのtrypsin消化物のAnhydrotrypsin Agaroseによる単離
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