この画面を閉じる

Application

Anhydrotrypsin Agarose

Application3:ヒトα1-antitrypsin(アミノ酸残基数394:C末端Lys)のC末端ペプチドフラグメントの単離5)

C末端にLysを有するα1-antitrypsinから、そのC末端ペプチドフラグメントを単離する場合、Application 1、2の方法は採用できない。
そこでtrypsinと異なる基質特異性を示すchymotrypsinでタンパク質を消化し、その消化フラグメント混合物からC末端にLysを有するC末端ペプチドフラグメントをAnhydrotrypsin Agaroseに吸着させて単離する方法をとった。
方法
(1)ヒトα1-antitrypsin(1.6 mg、31 nmol)を加熱処理後、chymotrypsin消化した(消化条件:1/100(w/w)TLCK-α-chymotrypsin、pH8.1、37℃、16 hr)。
(2)1 mM DFPを添加した消化物溶液をpH5.0に調整後、開始Bufferで平衡化したAnhydrotrypsin Agaroseカラム(ベッド体積4.7 ml、0.86φ×8.1 cm)に添加し、開始Buffer 20 mlでカラムを洗浄した。
(3)ゲルに吸着したペプチドの溶出は、0.1 Mギ酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)20 mlと0.1 Mギ酸(pH2.5)20 mlを混合した直線pH勾配により行った。
(4)ペプチドの検出は、fluorescamine反応による蛍光を測定することにより行った。
結果
pH3.0付近に唯一のペプチドピークが得られた。この画分を逆相系HPLC注3)にかけ、目的のC末端ペプチドフラグメントNo. 384-394を収率46%で得た。

注3)カラム:Nucleosil 5C18、0.4φ×25 cm
溶媒:(A)0.1%トリフルオロ酢酸、1%アセトニトリル
   (B)0.1%トリフルオロ酢酸、65%アセトニトリル
溶出:(A)→(B)の直線濃度勾配溶出、32 min
流速:1 ml/min
検出:A210
この画面を閉じる