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Application

Anhydrotrypsin Agarose

Application4:Anhydrotrypsin AgaroseによるC末端アミノ酸配列の解析例

モルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ(TGase)は、分子量約77,000の一本鎖ポリペプチドであり、そのcDNAの全塩基配列は、すでに伊倉らにより決定されている10)。TGaseのtrypsin消化物のAnhydrotrypsin Agaroseによるクロマトグラフィー非吸着画分からC末端ペプチドフラグメントが得られ(図7)、そのアミノ酸配列はAsn-Val-lle-lle-Gly-Pro-Alaと決定された(表3、4)。これはcDNA配列から考えられるC末端アミノ酸配列と完全に一致した。

表3 Anhydrotrypsin Agarose非吸着画分からのC末端相当ペプチドのアミノ酸組成分析 表4 Anhydrotrypsin Agarose非吸着画分からのC末端相当ペプチドのアミノ酸配列分析

アミノ酸

測定値

cDNA配列*

Asp+Asn

0.9

1.0

Val

0.8

1.0

lle

2.1

2.0

Gly

1.2

1.0

Pro

0.9

1.0

Ala

1.0

1.0

*cDNA配列より考えられるアミノ酸配列のC末端ヘプタペプチドから計算

サイクル

PTH誘導体

量(pmol)

1

Asn

64

2

Val

26

3

lle

20

4

lle

11

5

Gly

9

6

Pro

5

7

Ala

4

8

**

**

**サイクル8ではPTH誘導体確認されず。

TGase: 0.9mg (11 nmol)
 |←TPCK-treated trypsin消化
 | 反応条件
 |  11 nmol TGase/400μl of 1mM Tris-HCl, pH8.2, 20 mM CaCl2
 |    
 |  8μg TPCK-treated trypsin/8μl of 1 mM Tris-HCl, pH8.2, 20 mM CaCl2
 |    
 |  25℃, 13 hr反応
 |    
 |  4μl 0.1 M diisopropyl fluorophosphate (DFP) 添加 (反応停止)
 ↓←1.0 M 酢酸でpHを5.0~5.5に調整
trypsin消化物1/10量
 |←(1) Anhydrotrypsin Agarose (0.8×2.0cm) にアプライ
 |  平衡化緩衝液:50 mM CH3COONa, pH5.0, 20 mM CaCl2
 |←(2) 20 ml平衡化緩衝液で洗浄し非吸着画分回収
 |  (C末端ペプチド)
 |←(3) 0.1 M ギ酸で洗浄後,再平衡化
 |        (1)~(3)を6回繰り返す
 ↓
非吸着分120 ml
 |←逆相系Sep-Pak C18カートリッジにアプライ
 |←水洗後,65%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸で溶出
 |←溶出液を凍結乾燥
 |←400μl の0.1%トリフルオロ酢酸に溶解し,逆相系HPLC (C18) で分離 (図7)
 ↓
メインピーク分取
 ↓←アミノ酸分析 (表3),アミノ酸配列分析 (表4)
C末端アミノ酸配列:Asn-Val-lle-lle-Gly-Pro-Ala

図6 Anhydrotrypsin AgaroseによるTGaseのアミノ酸配列分析のプロトコール

図7 モルモット肝臓トランスグルタミナーゼトリプシン消化物のAnhydrotrypsin Agaroseカラムクロマトグラフィー非吸着画分に含まれるペプチドの逆相系HPLC

カラム:Cosmosil 5C18
溶出条件:0~64%直接密度勾配アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸
流速:1 ml/min
検出:A215

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