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Alkaline Phosphatase (Shrimp) (SAP)

SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase)による脱リン酸化反応

エッペンドルフチューブ内で以下の反応液を調製し、全量を50 μlとする。
DNA fragment in TE Buffer 1~10 pmol
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μl)  1~5 μl
10×SAP Buffer*1 5 μl
滅菌精製水 up to 50 μl

  ↓
37℃で15~30分間インキュベートする。
  ↓
65℃で15分間インキュベートする。*2(熱処理による失活)
  ↓
2.5 μlの3 M NaClを添加する。(終濃度150 mM)
  ↓
エタノール沈殿(2.5倍の冷エタノールを加え、-20℃で30~60分間保冷後、遠心分離)
  ↓
200 μlの70%冷エタノールで洗浄後、乾燥
  ↓
TE Buffer(20 μl以下)に溶解
*1 10×SAP Buffer
   500 mM Tris-HCl (pH9.0), 50 mM MgCl2
*2 大腸菌由来の酵素とは異なり、65℃で15分間の熱処理により完全に不可逆的に失活する。
(注意)平滑末端や3'突出末端の脱リン酸化には、BAP(Bacterial Alkaline Phosphatase)を用いた55℃~60℃での反応をお勧めする。
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