pBAsiベクターシリーズ

実験例-1; pBAsiベクターを用いたノックダウン

GFPのターゲット配列(GGAGTTGTCCCAATTCTTG)に対するヘアピン型RNA発現のためのオリゴDNA(下記)を合成し、それをpBAsi-hU6のBamHI-HindI部位に挿入し、siRNA発現用プラスミドベクターを構築した。ネガティブコントロールとして、ターゲット配列に対するスクランブル配列を用意した。

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BamH I target sequence (sense) Hairpin loop target sequence (antisense) Terminator  Hind III
Top strand 5'-GATCC GGAGTTGTCCCAATTCTTG CTGTGAAGCCACAGATGGG CAAGAATTGGGACAACTCC TTTTTT A-3'
Bottom strand 3'-G CCTCAACAGGGTTAAGAAC GACACTTCGGTGTCTACCC GTTCTTAACCCTGTTGAGG AAAAAA TTCGA-5'

293T細胞に、標的となるGFP発現ベクターとsiRNA発現ベクターをTransIT-293を用いて、コトランスフェクションし、24時間後に蛍光顕微鏡でGFPタンパクの発現状態を観察した(下写真)。その結果、siRNA発現ベクターによるGFPタンパクの発現抑制が確認できた。

(1) 細胞のみ


(2) GFP発現ベクター0.2 μg+pBAsi-hU6-NC 0.3 μg(ネガティブコントロール)


(3) GFP発現ベクター0.2 μg+pBAsi-hU6-GFP 0.3 μg

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