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Application

DNA Ligation Kit <Mighty Mix>

【標準プロトコール】の使用例

突出末端のベクターライゲーション
pUC118 Hind III/BAP (製品コード 3324) (50 ng, 25 fmol) に、564 bpのλDNA由来のHind III断片 (2.5~150 fmol) を加えたDNA溶液7.5 μlにLigation Mix 7.5 μlを加え、16℃で30分間反応した。反応液のうち10 μlで、E. coli JM109コンピテントセル (7.3×108 cfu/μg pUC118) を形質転換し、X-Gal、IPTGを含むL-ampプレート上でコロニーを形成させ、コロニー数を計測して形質転換効率を調べた。結果を以下に示す。
Insert/vector (モル比)形質転換効率
(colonies/μg vector)
白コロニー率 (%)
whiteblue
-3.8×1042.5×10513.0
1/105.6×1052.4×10570.2
1/41.1×1062.4×10582.9
14.3×1062.4×10592.6
38.2×1063.3×10596.2
69.1×1062.4×10597.4

平滑末端のベクターライゲーション
pUC118 Hinc II/BAP (製品コード 3322) (50 ng, 25 fmol) に、500 bpのλDNA由来のHinc II断片 (2.5~150 fmol) を加えたDNA溶液7.5μlにLigation Mix 7.5 μlを加え、16℃で30分間反応した。反応液のうち10 μlで、E. coli JM109コンピテントセル (7.3×108 cfu/μg pCU118) 100 μlを形質転換し、X-Gal、IPTGを含むL-ampプレート上でコロニーを形成させ、コロニー数を計測して形質転換効率を調べた。結果を以下に示す。。
Insert/vector (モル比)形質転換効率
(colonies/μg vector)
白コロニー率 (%)
whiteblue
-1.6×1042.1×1056.7
1/105.6×1052.3×10570.6
1/41.1×1062.2×10583.0
14.2×1063.0×10593.4
37.5×1062.6×10596.7
66.7×1063.7×10594.8



得られた白色コロニーについて、PerfectShot Insert Check PCR Mix (製品コード RR020A) を用いてインサートチェックを行った。
InsertInsert:Vector
0.1:13:1
λ564/Hind III21/2424/24
λ500/Hinc II24/2422/24


Insert/Vector比は1以上で効率よく陽性クローンを得ることができ、6以上では、形質転換効率が低くなる場合があります。Insert/Vector比を3程度として実験することをお勧めします。
また、Insert DNAの鎖長が短いとマルチライゲーション (Insert DNAが複数つながってVectorに挿入される反応) の頻度が高くなります。マルチライゲーションはInsert/Vector比が高い程起こりやすくなるので、マルチライゲーションの頻度が高い場合は、Insert/Vector比を下げて検討してください。
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