PrimeScript™ II High Fidelity RT-PCR Kit

鋳型量の許容範囲の検討(2ステップRT-PCR)
PrimeScript™ II High Fidelity RT-PCR Kit(製品コード R023A)

【方法】

HL60細胞由来のtotal RNA(100 pg、1 ng、10 ng、100 ng、200 ng、500 ng、1 μg、2 μg、3 μg、4 μg、5 μg、6 μg)を鋳型として用い、本キットのプロトコールにより Oligo dT Primer を用いた逆転写反応を行った。
その一部(5 μl)をPCRに使用し、トランスフェリンレセプター(TFR)4 kbを増幅した。
PCR条件:98℃  10 sec.
 
30 cycles
55℃15 sec.
68℃4 min.

【結果】

 鋳型量(50 μl PCR 反応系)
1total RNA 25 pg 相当
2total RNA 250 pg 相当
3total RNA 2.5 ng 相当
4total RNA 25 ng 相当
5total RNA 50 ng 相当
6total RNA 125 ng 相当
7total RNA 250 ng 相当
8total RNA 500 ng 相当
9total RNA 750 ng 相当
10total RNA 1 μg 相当
11total RNA 1.25 μg 相当
12total RNA 1.5 μg 相当
Mλ-Hind III digest

RT反応時のtotal RNA量を6 μg/20 μlまで増やしても、問題なく良好なTFR遺伝子の増幅が確認できた。

  PrimeScript™ II High Fidelity RT-PCR Kit