この画面を閉じる

Application

pDON-5 DNA

使用例

1.方法
pDON-AI-2 Neo DNA、pDON-AI-2 DNA、pMEI-5 Neo DNA、pMEI-5 DNA、pDON-5 Neo DNA、pDON-5 DNA(製品コード 3653、3654、3655、3656、3657、3658)のBamH I/Hpa IサイトにZsGreen遺伝子を挿入し、pDON-AI-2 Neo-ZsGreen、pDON-AI-2-ZsGreen、pMEI-5 Neo-ZsGreen、pMEI-5-ZsGreen、pDON-5 Neo-ZsGreen、pDON-5 DNA-ZsGreenベクターを作製した。Retrovirus Packaging Kit Ampho(製品コード 6161)を用いてG3T-hi細胞(製品コード 6163)へ導入し、一過性の組換えレトロウイルスを産生した。
2.結果
2-1.ウイルスタイターの比較(表1、図1)
(1) HT1080細胞へ段階希釈したレトロウイルスベクターをポリブレン存在下にて感染させ、フローサイトメーターにてZsGreenの導入効率を測定し、ウイルスタイターを算出した。
(2) HT1080細胞へ段階希釈したレトロウイルスベクターを感染させ、G418にて薬剤選択を行い形成されたコロニー数よりウイルスタイターを算出した。(Neoシリーズのみ)
(3) Retrovirus Titer Set (for Real Time PCR)(製品コード 6166)を使用し、レトロウイルスベクターのRNAゲノム量を測定し、RNAタイターを算出した。タイター算出用のスタンダードとして、(1)の方法にてあらかじめ生物学的タイターを算出したDON-AI-2-ZsGreenレトロウイルスを使用した。

表1:ウイルスタイターの比較

(1)ZsGreen/HT1080 (2)G418/HT1080 (3)RNA titer
ivp/ml cfu/ml ivp/ml
DON-AI-2 Neo 4.08×106 4.43×106 1.01×107
DON-AI-2 7.35×106 - 2.23×107
MEI-5 Neo 3.96×105 5.88×105 8.47×105
MEI-5 1.31×106 - 2.48×106
DON-5 Neo 2.65×106 3.83×106 6.81×106
DON-5 3.26×106 - 8.59×106



2-2.発現強度の比較(図2)
レトロウイルスベクターを種々の希釈倍率にてポリブレンを用いた方法でHT1080細胞へ感染させた。感染3日後に、フローサイトメーターを用いて遺伝子導入効率およびZsGreen発現強度を測定した。遺伝子導入効率が20%以下の希釈倍率での発現強度をsingle copy導入細胞とみなし、発現強度の比較を行った。各細胞でのDON-AI-2ウイルスベクターの発現強度を1とした時の値を示す。

この画面を閉じる