Synthetic siRNA Quantitation Kit

培養細胞に合成siRNAをトランスフェクションし、RNAi効果を確認した。さらにトランスフェクションした培養細胞からtotal RNAを調製し、本製品を用いて合成siRNA残存量を定量した。

【方法】
24ウェルプレートにHEK293細胞を1×10⁵ cells/ウェルで播種し、約24時間培養した後、TransIT-LT1により分泌型ルシフェラーゼ（MetLuc2）発現ベクターpMetLuc2-Control（500 ng）を、TransIT-TKOによりMetLuc2遺伝子の発現をノックダウンするMetLuc2 siRNA（7.5 pmol）をCo-transfectionした（2連で実施）。
24時間後、培養上清を回収して分泌されたルシフェラーゼの発光を測定し、各細胞よりRNAサンプルを50 μl調製した^{* 1}。
その後、EASY Dilution (for Real Time)により100倍希釈し、測定サンプルとして5 μlを使用し、本製品の操作に従ってcDNAを調製した。調製したcDNAを鋳型に、TB Green Premix Ex Taq II (Perfect Real Time)^＊2およびアンチセンス鎖特異的なプライマーを使用してリアルタイムPCRを行い、MetLuc2 siRNAの定量を行った。



【結果】

• ノックダウン効果の確認（発光測定）
  Controlには非特異的な配列を持つ合成siRNAをトランスフェクションした細胞を使用しました。MetLuc2 siRNAをトランスフェクションした細胞の発光値はControlの発光値と比較して、平均7.6%（ウェル1：7.8%、ウェル2：7.4%）となり、RNAiによるノックダウン効果を確認することができました。
  
  


• MetLuc2 siRNAの定量（リアルタイムPCRの結果）
  MetLuc2 siRNAおよび内部標準siRNAの10倍希釈系列を使用して検量線を作成し、MetLuc2 siRNAおよび内部標準siRNAを定量したところ、以下の結果が得られました。
  
  

  	既知量	MetLuc2 siRNA		内部標準siRNA
  		Ct	定量結果	Ct	定量結果
  スタンダード1	10 fmol	20.71	-	17.38	-
  スタンダード2	1 fmol	24.53	-	20.89	-
  スタンダード3	100 amol	28.85	-	24.61	-
  スタンダード4	10 amol	32.73	-	28.55	-
  スタンダード5	1 amol	36.43	-	32.17	-
  サンプル(ウェル1)	-	28.73	96 amol	21.79	610 amol
  サンプル(ウェル2)	-	27.47	199 amol	21.67	657 amol

  
  
  

  RNA調製時に添加した内部標準siRNAの定量値から、以下の計算式に従って、siRNAの回収率をもとめました。

  
  
  
  サンプル（ウェル1）の場合
  
  

  リアルタイムPCRにより得られたMetLuc2 siRNAの定量値およびsiRNAの回収率（上記）より、培養細胞に残存しているMetLuc2 siRNAの量をもとめました。

  
  
  サンプル（ウェル2）の場合
  
  

  これらの結果より、MetLuc2 siRNA残存量はサンプル（ウェル1）では157 fmol、サンプル（ウェル2）では303 fmolとなりました。