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次世代シーケンス(NGS)解析への応用例(207 plex PCR)

Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(製品コード RR062A/B)
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2(Life Technologies社)と本製品を用いて、ヒトゲノムDNAを鋳型に207ターゲットのマルチプレックスPCRを行い、ライブラリーを作成してNGS解析を実施した。
また、そのうち任意に選択した16ターゲットについて、マルチプレックスPCR後の増幅産物をqPCRで定量し、増幅前のヒトゲノムDNAの定量値(PC)およびC社製品での増幅産物の定量値と比較することで、PCRによる増幅バイアスの程度を確認した。
Coverage解析結果
Number of mapped reads4,996,633
Uniformity of amplicon coverage94.2%
Amplicons with at least 500 reads100%
The percentage of bases in all targeted regions (or whole genome) covered by at least 0.2X the average base read depth
約500万リードの解析において、207ターゲットすべてで500リード以上シーケンスできており、全ターゲットがきちんと増幅できていることが確認できた。
・鋳型 ヒトゲノムDNA 20 ng
・Primer Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2
(Life Technologies)
・PCR試薬 本製品(製品コード RR062A)
Multiplex PCR Enzyme Mixは通常の
1.5倍量(0.15 μl / 20 μl反応系)を使用
・PCR条件 94℃ 1分
→(94℃ 30秒/60℃ 4分)×17 cycles
→72℃ 10分
・NGS Ion 318 Chip / Ion PGM Sequencer
(Life Technologies)
マルチプレックスPCR後の遺伝子増幅の確認

NDは検出限界以下を示す                  (弊社比較データ)

本製品の増幅産物からは16種すべてのターゲットでCt値が得られ、検出できないターゲットも見られるC社製品の増幅産物と比較して、バイアスの少ない増幅ができていることが示唆された。
・qPCRの鋳型PCR増幅産物の1,000倍希釈液
1 μl / 25 μl反応系
(PC ; ヒトゲノムDNA 100 ng / 25 μl反応系)
・qPCR試薬MightyAmp for Real Time (SYBR Plus)
(製品コード R075A)
C社製品のマルチプレックスPCRは推奨条件で反応
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