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ヒト神経幹細胞・培地キット

神経幹細胞から神経細胞およびアストロサイトへの分化誘導実験

神経細胞への分化誘導(分化誘導法A)
【方法】
Day0  RHB-A培地で長期培養したHuman Neural Cortex Cell Lineを神経分化培地-1に懸濁し、poly-L-ornithine(Sigma-Aldrich社)およびLamininでコートしたプレートに2.5×104 cells/cm2となるように播種した。。
Day1~6 神経分化培地-1で培養を継続し、2日に1回培地交換を行った。
Day7~13 神経分化培地-2で培養を継続し、2日に1回培地交換を行った。
Day14~28神経分化培地-3で培養を続し、2日に1回培地交換をった。

※培地の組成
<神経分化培地-1>
Basal培地:RHB-Basal(製品コード Y40000)
添加剤0.5% NDiff N2-AF(製品コード Y40110)
1.0% B-27 Supplement (50X), serum free(Thermo Fisher Scientific, cat. 17504044)
10 ng/mL Animal-Free Recombinant Human FGF-basic(Peprotech, cat. AF-100-18B)

<神経分化培地-2>
Basal培地 1:1 v/v RHB-Basal(製品コード Y40000)/ Neurobasal Medium, minus phenol red(Thermo Fisher Scientific, cat. 12348017)
添加剤0.25% NDiff N2-AF(製品コード Y40110)
1.0% B-27 Serum-Free Supplement
10 ng/ml Human FGF-basic
0.5% GlutaMAX Supplement(Thermo Fisher Scientific, cat. 35050061)

<神経分化培地-3>
Basal培地:Neurobasal Medium, minus phenol red
添加剤2.0% B-27 Serum-Free Supplement
20 ng/ml Recombinant Human/Murine/Rat BDNF(Peprotech, cat. 450-02)
1.0% GlutaMAX I(100×)

【結果】

図1.分化誘導28日目の蛍光顕微鏡写真
GFAP(緑)とMAP2(赤)の蛍光二重免疫染色にて、MAP2陽性細胞(神経細胞)への分化が確認できた。
アストロサイトへの分化誘導(分化誘導法B)
【方法】
1.Day0  RHB-A培地で長期培養したHuman Neural Cortex Cell Lineをアストロサイト分化培地に懸濁し、poly-L-ornithine(Sigma-Aldrich社)およびLamininでコートしたプレートに2.5×104 cells/cm2となるように播種した。
2.Day1~22 アストロサイト分化培地で培養を継続し、2日に1回培地交換を行った。

※培地の組成
<アストロサイト分化培地>
Basal培地: RHB-A(製品コード Y40001)
添加剤:10 ng/ml BMP-4, Human, Recombinant, Carrier-free(R&D Systems, Inc., cat. 314-BP-010)


図2.分化誘導22日目の蛍光顕微鏡写真
GFAP(緑)とMAP2(赤)の蛍光二重免疫染色にて、GFAP陽性細胞(アストロサイト)への分化が確認できた。
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