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Tks Gflex™ DNA Polymerase

【ユーザー様実施例 3】相同組換えマウスES細胞株由来のクルードサンプルからの簡便なスクリーニング法

データご提供:
東京大学医科学研究所 幹細胞治療研究センター 幹細胞治療分野
水野 直彬先生、山口 智之先生


サンプル:マウスES細胞
ターゲット名: 非公開
増幅サイズ :3,053 bp
GC含量:48%
M:Ladder Marker
1:クローンA
2:クローンB
3:クローンC
4:クローンD
5:クローンE
(取得したクローンの結果を抜粋して掲載)

マウスES細胞のゲノムDNAに目的DNA断片を相同組換えにより導入する実験を行った。ターゲティングベクター導入(transfection)により薬剤耐性となったコロニーを96穴プレートにピックアップし、各ウェルにLysis Buffer*を添加しクルードサンプルを調製後、Tks Gflex DNA Polymeraseを用いて推奨通りの反応組成でPCRを行った。
サンプル調製のプロトコールはこちら。
本実験ではユーザー様ご自身でLysis Bufferを調製・使用されました。Buffer組成は弊社製品(Lysis Buffer for PCR(製品コード 9170A))と同じものですが、弊社プロトコール(試料をLysis Bufferに添加後、Proteinase Kを添加)ではなく、Lysis BufferとProteinase Kを混合したものを試料に添加しています。Buffer組成の詳細はこちらをご参照ください。
注:クルードサンプルに使用するLysis Bufferを自製する場合は、濃度変更が結果に大きく影響しますので、必ず開示通りの組成で調製してください。

PCR条件:
94℃
1 min
98℃
60℃
68℃

10 sec.
15 sec.
60 sec./kb
(180sec.)
 35 cycles

結果
103クローン中、10クローンが相同組換えES細胞株であることをLysis BufferTks Gflexを用いたクルードサンプルからのPCRで確認した。

ご感想:
ES細胞で相同組換えやCRISPR/Cas9を用いたmutagenesisを行う場合、PCRによるスクリーニングでは多数のクローンを同時進行で処理する必要があるため、、各クローン細胞株の細胞数などをそろえるなど「最適化」することは極めて面倒です。Tks Gflex DNA Polymeraseは、「クルードサンプルからのPCRができる」、「鋳型の条件がバラついても結果に大きな影響がない」、「PCRサイクル条件を検討しなくても、ほぼ同一条件で安定している」、「サイクル数を増やしても非特異的増幅を認めない」などの条件をすべて満たす「最適化不要」な非常に優秀なPCR酵素としてお勧めできる製品です。
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