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In-Fusion® HD Cloning Kit

ユーザー様実施例6:In-Fusion® Cloning Kitを使用したAAVベクターの改変

In-Fusion HD Cloning Kitによる複数フラグメントの同時クローニングで、AAVベクターのプロモーターやマルチクローニングサイト等の改変を行った。
■実験1
インサート:500 bp、300 bp
ベクター:3,900 bp
① ベクター、インサートともにPCRで調製し、In-Fusionを使って複数インサートを一度にクローニングした。
② コンピテントセルに形質転換し、2種類のプライマーセットにてコロニーPCRを行い、22個のコロニー中13個が陽性であることを確認した。

③ コロニーPCRで陽性であったクローンを2、3個拾ってプラスミドを精製し、複数の制限酵素での切断およびシーケンスを行い、目的の組換え体であることを確認した。
④ 作成した改変ベクターが機能することを確認するため、2.7 kbのインサートを改変ベクターに組み込み、プラスミド精製後COS7細胞にトランスフェクションしウェスタンブロットにて目的タンパクの発現を確認した。
■実験2
インサート:2,794 bp、1,200 bp、500 bp
ベクター:3,400 bp
① ベクター、インサートともにPCRで調製し、In-Fusionを使って複数インサートを一度にクローニングした。
② コンピテントセルに形質転換し、4種類のプラマーセットを用いてコロニーPCRを行い7個のコロニー中1個が陽性であることを確認した。

③ コロニーPCRで陽性であったクローンのプラスミドを精製し、複数の制限酵素での切断およびシーケンスを行い、目的の組換え体であることを確認した。
【ユーザー様のコメント】
- In-Fusionを使った感想はいかがでしたか?
今まで地道にライゲーションキットと制限酵素で何回もクローニングをしていましたが、In-Fusionでマルチクローニングを行うと1回で済むのですごく楽になりました。もっと早くから使えばよかったです。
- In-Fusionを使ったことがないユーザー様に一言お願いします。
簡単なので一度使ってみましょう!
【データご提供】  名古屋大学 医学部 K先生
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