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ゲノム編集による動物作製

CRISPR/Cas9システムを利用したノックイン動物の作製実施例

ゲノム編集技術を用いた一塩基置換や数塩基挿入変異を有するノックイン動物の作製は、効率が低いことが問題となっています。タカラバイオでは、表現型として毛色で判断できるチロシナーゼ遺伝子座をターゲット領域として、フレームシフトや終始コドンへの置換変異による遺伝子改変動物の作製を検討しました。動物作製検討には、sgRNAとCas9タンパク質を高効率に迅速に導入できるエレクトロポレーションによる導入法を利用しています。

■ ssODNを用いたノックイン動物モデルの作製方法
ssODNデザインの最適化
数塩基挿入によるフレームシフトと1塩基置換による終始コドン作製用ssODNデザインの最適化を図り、メラニン色素をつくり出す酸化酵素Tyrosinase遺伝子座をターゲット領域として、遺伝子改変動物の作製を検討しました。
ssODNを用いたノックイン動物モデルの作製方法

エレクトロポレーション法による導入
C57BL/6NCrSlcマウスの受精卵にsgRNAとCas9タンパク質およびssODNをエレクトロポレーション法で導入し、数塩基挿入によるフレームシフト法と1塩基置換による終始コドン作製法を用いたノックイン動物のゲノム編集評価系を構築しました。
■ ダイレクトシーケンスによるノックイン動物モデル作製効率の結果


XbaI挿入
変異匹数確率
目的箇所変異(ホモ)29%
目的箇所変異(ヘテロ)732%
目的箇所変異(モザイク)314%
その他の変異1045%
数塩基挿入によるフレームシフト法を用いたノックイン動物(F0)取得実績


1塩基置換
変異匹数確率
目的箇所変異(ホモ)25%
目的箇所変異(ヘテロ)922%
目的箇所変異(モザイク)12%
目的箇所変異+その他の変異717%
その他の変異1639%
変異なし615%
1塩基置換による終始コドン作製法を用いたノックイン動物(F0)取得
1塩基置換による終始コドン作製法を用いたノックイン動物(F0)取得実績
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