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Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)

アデノ随伴ウイルス上のドナーDNAを用いた高効率ノックイン―ゲノム編集

【実験の流れ】
実験の流れ
【方法】 ドナー AAVベクターの調製
試薬等の準備
AAV作製キット:AAVpro Helper Free System(AAV6)(製品コード 6651)
ライゲーションキット:DNA Ligation Kit <Mighty Mix>(製品コード 6023)
プラスミド調製キット:NucleoBond Xtra Midi(製品コード 740410.10など)
HEK293T細胞
トランスフェクション試薬:TransIT-293 Transfection Reagent(製品コード MIR2704)
AAVベクター力価測定キット:AAVpro Titration Kit(for Real Time PCR)Ver.2(製品コード 6233)
pAAV-CMV Vectorへの目的遺伝子のクローニングとベクタープラスミドの調製
AAVpro Helper Free System(AAV6)のpAAV-CMV VectorをCla I処理することで、プロモーター領域からPoly A配列を除去し、ITRとITRの間に、相同組換えに必要なフラグメント(L・R-arm)とAcGFPを含むフラグメントを挿入した。クローニングにはDNA Ligation Kit<Mighty Mix>を用いた。その後、目的遺伝子を含むプラスミドを調製した。
HEK293T細胞へのトランスフェクション
調製したベクタープラスミドとAAVpro Helper Free System(AAV6)中のpRC6 VectorおよびpHelper Vectorのプロトコールに従い、TransIT-293 Transfection Reagentを用いてトランスフェクションした。
AAVベクターの回収
トランスフェクションの翌日に培地を2%FBS含有DMEMに交換した。トランスフェクションから2日後に0.5 M EDTA(pH8.0)を終濃度6.25 mMとなるように培地に加えて細胞を剥離し、AAV Extraction Solutionを使用してベクターを抽出した。
ウイルス力価の測定
AAVpro Titration Kit (for Real Time PCR) Ver.2を用いて、AAVベクターの力価測定を実施した。
ドナ―AAVベクタープラスミドのマップ

ドナーAAVベクタープラスミドのマップ
(クリックで拡大します)
【方法】 ゲノム編集・感染
試薬等の準備
Cas9タンパク質:Guide-it Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)(製品コード 632641など)
sgRNA:Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit(製品コード 632635)によりGAPDH遺伝子に対するsgRNAを調製
ドナーAAVベクター:調製したドナーAAVベクター
Cas9 Plasmid:Cas9発現プラスミド
sgRNA Plasmid:sgRNA発現プラスミド
ドナーPlasmid:L・R-armとAcGFP発現プラスミド
遺伝子導入機器:Neon Transfection System(Thermo Fisher Scientific社)
1日目:ゲノム編集・感染
実験1.Cas9 PlasmidとsgRNA PlasmidとドナーPlasmidを使用
  1. ドナーPlasmid とsgRNA Plasmid、Cas9 Plasmidを混合する。
  2. HEK293T細胞を1×105 cells/10 μlになるように、1)の溶液で懸濁する。
  3. Neon Transfection Systemを用いてエレクトロポレーションを実施する。
  4. プレートに播種して、培地で培養する。
実験2.RNPとドナーPlasmidを使用
  1. Cas9タンパク質とsgRNAを加えピペッティングしてRNP溶液を調製する。
  2. RNP溶液を37℃で5分間インキュベート
  3. ドナーPlasmidを混合する。
  4. HEK293T細胞を1×105 cells/10 μlになるように、3)の溶液で懸濁する。
  5. Neon Transfection Systemを用いてエレクトロポレーションを実施する。
  6. プレートに播種して、培地で培養する。
実験3.RNPとドナーAAVベクターを使用
  1. Cas9タンパク質とsgRNAを加えピペッティングしてRNP溶液を調製する。
  2. RNP溶液を37℃で5分間インキュベート
  3. HEK293T細胞を1×105 cells/10 μlになるように、2)の溶液で懸濁する。
  4. Neon Transfection Systemを用いてエレクトロポレーションを実施する。
  5. プレートに播種する。
  6. ドナーAAVベクターをMOI 900でプレートの細胞へ添加してAAVを感染させる。
  7. インキュベート
ドナーAAVベクタープラスミドのマップ

ドナーPlasmidのマップ
(クリックで拡大します)
3~4日目:細胞の継代
細胞を剥離し継代
7日目:フローサイトメーターによるノックイン効率の測定
HEK293T細胞のAcGFP発現細胞の割合をFlow cytometryを用いて解析し、ノックイン効率を測定した。
NTは無処理の細胞を示す。
【結果】
結果
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