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レジオネラ属菌検査 生菌検出法(LC EMA-qPCR法)

<レジオネラ属菌迅速検査法について>浴槽水を用いた検討
岐阜県保健環境研究所報 第23号(2015)4-7 より引用

検討:

平成25年9月~平成26年11月に採取された県内入浴施設の浴槽水95検体を試料として、培養法、LAMP法及びLC EMA-qPCR法によるレジオネラ属菌の検出を行った。培養法は、新版レジオネラ症防止指針記載のろ過濃縮法に準じ、当所の他、県内4機関(岐阜保健所(平成25年度)、西濃保健所、東濃保健所、飛騨保健所)において分担して実施した。


方法:

  • LAMP法
    Loopampレジオネラ検出キットE(栄研化学)を用い、リアルタイム濁度測定装置(栄研化学)で測定を行った。なお、添付文書ではDNA抽出に検水の5,000倍濃縮液を用いるところを、本研究では検体調製の都合上、1,000倍濃縮液を用いた。それ以外の手順は添付文書に従った。
  • LC EMA-qPCR法
    検水の1,000倍濃縮液100 μLに等量の酸処理液(0.2M KCl-HCl, pH2.2)を加え、室温で5分間静置後、MWY液体培地900 μLを加え36℃、18時間培養した。培養後の培養液を用い、EMA処理、DNA抽出及びqPCRを順次実施した。EMA処理、DNA抽出、qPCRにはそれぞれViable Legionella Selection Kit for LC EMA-qPCR(タカラバイオ)、Lysis Buffer for Legionella(タカラバイオ)、Cycleave PCR Legionella(16S rRNA)Detection Kit(タカラバイオ)の各キットを添付文書に従い使用した。リアルタイムPCR装置は、StepOnePlus™リアルタイムPCRシステム(Life Technologies)を使用した。
    また、液体培養前後及びEMA処理前後の遺伝子検出の変化を観察するため、液体培養前(0hLC)及び液体培養後(18hLC)時点の検体についても同様にDNA抽出及びqPCRを実施した。

結果:

浴槽水95検体中、培養法では27検体(28.4%)から10CFU/100 mL以上のレジオネラ属菌が検出され、LAMP法では37検体(38.9%)から、LC EMA-qPCR法では45検体(47.4%)からレジオネラ属菌遺伝子が検出された。
LAMP法では、培養法陽性27検体中21検体が陽性となり、培養法に対する感度は77.8%であった(表1)。また、培養法陰性68検体中52検体が陰性となり、特異度は76.5%あった。培養法陽性かつLAMP法陰性となった6検体の菌数の内訳は、10 CFU/100 mLが4検体、20 CFU/100 mL及び100 CFU/100 mLが各1検体であった。

表1.LAMP法と培養法の比較

LC EMA-qPCR法では、培養法陽性27検体すべてにおいてレジオネラ属菌遺伝子が検出され、遺伝子検出を陽性とした場合、培養法に対する感度は100%であった(表2)。一方、培養法陰性68検体中50検体がレジオネラ属菌遺伝子不検出であり、特異度は73.5%であった。

表2.LC EMA-qPCR法と培養法の比較(遺伝子検出=陽性)

培養法による生菌数(CFU/100mL)と遺伝子定量値(コピー/mL)の間には、ややばらつきはみられるものの比較的良好な相関が認められた(図1)。

図1.LC EMA-qPCR法(18hLC/EMA(+))定量値と培養法菌数との相関

定量値10コピー/mL以上をLC EMA-qPCR法陽性とした場合、培養法に対する感度は96.3%、特異度88.2%となり、特異度が改善された(表3)。

表3.LC EMA-qPCR法と培養法の比較(10コピー/mL以上=陽性)

培養法陰性68検体のうち、LC EMA-qPCR法でレジオネラ属菌遺伝子が検出された18検体の定量値を、液体培養前(0hLC)、液体培養後(18hLC)の定量値及びLAMP法の結果と併せて表4に示した。18検体中11検体(No.1~11)については、液体培養後に定量値の増加が認められないことから、死菌由来遺伝子を検出したものと考えられた。7検体(No.12~18)については、液体培養後に定量値の増加が認められることから生菌が存在したと推察されるが、LAMP法でも不検出となる検体が多いことから、培養法では検出されない程度のわずかな生菌が存在していたと考えられた。

表4.培養法陰性、LC EMA-qPCR法検出の不一致例

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