特長

• iPS細胞作製にもご利用いただけます
• 高効率遺伝子発現用ベクターまたは高発現遺伝子導入用ベクターを使用
• 安定発現細胞作製も承ります

概要

タカラバイオでは、高効率遺伝子導入用レトロウイルスベクターpDON-AI-2 DNA、高発現遺伝子導入用レトロウイルスベクターpMEI-5 DNA、高効率かつ高発現遺伝子導入用レトロウイルスベクターpDON-5 DNAおよび一過性ウイルス産生システムRetroviurs Packaging Kitを販売しています。
レトロウイルス作製受託サービスでは、これらのベクターおよびシステムを用いて、目的遺伝子を挿入した組換えレトロウイルスを作製いたします。

レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入法は、一般的に以下の利点を持ち、動物細胞への効果的な遺伝子導入法として、多くの遺伝子導入実験に利用されています。

1. 安定な遺伝子導入細胞株を得ることができる。
2. ヒト、マウスおよびラットを含む多くの動物細胞に遺伝子導入できる。
3. 増殖細胞であれば、血球系を含む多くの細胞株に遺伝子導入できる。
4. 初代培養細胞にも効率よく遺伝子導入ができる。

■レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入 レトロウイルスゲノムからパッケージングシグナル（ψ）と両端のLTR配列を残し、目的遺伝子が挿入された組換えレトロウイルスベクターは、標的細胞の染色体に確実に目的遺伝子を挿入できるため、長期安定遺伝子発現が期待できます。本受託サービスでは、レトロウイルスの構造タンパク質であるgag-pol、envを発現するプラスミドベクターと、組換えレトロウイルスゲノムmRNAを発現する組換えレトロウイルスベクタープラスミドを宿主細胞に同時トランスフェクションすることによって一過性に組換えレトロウイルスベクターを取得します。 レトロウイルス調製用の宿主細胞としては、一過性のトランスフェクション効率が高いG3T-hi細胞を使用します。gag-pol発現ベクター、env発現ベクター、および組換えレトロウイルスベクタープラスミドを同時トランスフェクションすることによって、G3T-hi細胞内で発現したgag-polタンパク質、envタンパク質、および組換えレトロウイルスゲノムRNAがアセンブルして組換えレトロウイルス粒子が出芽します。エンベロープ遺伝子はマウス、ラットに感染可能なecotropic-env、あるいはヒトを含む多くの哺乳動物細胞に感染可能なamphotropic-envから選択していただきます。トランスフェクションから48時間後の培養上清をフィルターろ過して組換えレトロウイルス液とし、小分け分注して納品いたします。

サービス内容

A〜Cのステップ毎にご注文いただけます。

1. 組換えプラスミドベクターの作製

   ・目的の遺伝子を挿入した発現プラスミド作製
   ・挿入遺伝子のサイズ、挿入接続部位の塩基配列を確認

   * pDON-AI-2 DNA、pMEI-5 DNAまたはpDON-5 DNAベクターを使用します。ご指定のレトロウイルスベクターでの構築も可能です。

2. 組換えレトロウイルスの作製

   ・組換えレトロウイルスを一過性に産生
   ・ウイルスを含む培養上清をろ過

   * 標的とする細胞に適したウイルスエンベロープを選んでいただきます。マウス、ラット細胞への感染にはエコトロピックウイルスを、ヒトを含む多種の哺乳類細胞への感染にはアンフォトロピックウイルスを選択できます。

   * この段階でin vitroの実験にご使用いただくことができます。

3. ウイルスの力価測定：ネオマイシン耐性コロニー検出法

   ・標的細胞に希釈ウイルス液を用いて感染
   ・ネオマイシン（G418）による薬剤選択
   ・薬剤耐性コロニーを検出し、力価決定

   * 標的細胞は、マウスNIH/3T3細胞を使用いたします。

   * ウイルス力価として得られる数値は、ウイルス液1 mlあたりのネオマイシン耐性コロニー形成能を示します（Neomycin^® colony forming unit/ml）。

   * ウイルスの力価は、測定方法により異なります。また、ウイルス液の組成、測定に使用する細胞や血清などの影響により、同じ方法であっても施設によって異なることがあります。ご了承ください。

• ウイルスの簡易濃縮（20〜40倍濃縮）
• ウイルスの恒常産生細胞の作製（プロデューサー細胞の作製）
• GFPによるウイルスの力価測定
• 安定発現細胞株作製（組換えレトロウイルスを一過性に産生し薬剤選択により遺伝子導入細胞取得）

価格・納期

納品物

• 組換えウイルス液　約10 ml
• 作業報告書

ご注文方法

• 以下のフォーマットにご記入のうえ、上記受託窓口までご送付ください。
  • 組換えウイルス作製受託見積依頼書フォーマット（PDF、32.1 K）
    
    組換えウイルス作製受託見積依頼書フォーマット（Excel、47.0 K）
• 以下の手続きの後に実際のサービスを開始します。
  手続きに必要な書類（＜＞内）は順次準備し、送付させていただきます。
  1. 挿入遺伝子に関する情報を開示いただく。＜遺伝子情報書式＞
     タカラバイオ社 遺伝子組換え実験安全委員会への申請に必要な情報（遺伝子産物の性質等）をお知らせいただきます。所定の書式にご記入ご返送ください。
     情報の扱いには十分注意を払っております。また、覚書(3)には秘密保持条項が含まれていますが、情報開示にあたり、特に、秘密保持契約を必要とされる場合はご用意いたします。
  2. タカラバイオ社 安全委員会において、開示いただいた遺伝子情報をもとに、必要とされる物理的封じ込めレベルを判断し、折り返しご連絡させていただきます。
     P2レベル以下で扱うことができない場合、サービスをお断りすることになります。
  3. ご希望の場合、覚書を締結します。＜覚書＞
  4. サンプルおよびサンプル情報をお送りいただき、カスタムサービスを開始します。 ＜サンプル情報書式 （遺伝子配列情報含む）＞

受入サンプル

• 組換えプラスミドの作製からの場合プラスミドDNA10 μg以上
• 組換えレトロウイルスの作製からの場合　プラスミドDNA50 μg以上
• ウイルスの力価測定からの場合組換えウイルス液500 μl

ご留意事項

• 組換えレトロウイルスの取り扱いは、挿入されている遺伝子の全塩基配列が既知で、かつ、その遺伝子が毒性あるいは病原性等を示さず安全であると判断できる場合に限りP2レベルで扱うことができます。本サービスでは、P2レベルで扱うことのできる場合のみ、ご依頼をお受けしています。