製品説明

本製品は、少量の蛍光色素を用いて、RNAサンプルから効率よく蛍光標識cDNAターゲットを調製するためのキットである。DNAチップ（DNAマイクロアレイ）を用いた二色蛍光標識法による発現解析など、蛍光標識ターゲットを用いて核酸検出実験を行う際に使用できる。逆転写酵素としてM-MLV Reverse Transcriptase（RNase H⁻）を使用し、TaKaRa DNAチップIntelliGeneでの解析に至適化している。
Ver.2.0では、蛍光標識の反応系が、Cy3標識、Cy5標識のそれぞれに対して更に最適化されており（特許第4225906号）、より精度の高い解析が可能となった。

内容

1.	M-MLV Reverse Transcriptase （200 U/μl）	20 μl
2.	5×reaction buffer	100 μl
3.	10×dNTP Mixture for Cy3 labeling	20 μl
4.	10×dNTP Mixture for Cy5 labeling	20 μl
5.	Oligo dT（18）primer（300 pmol/μl）	10 μl
6.	Random hexamer（300 pmol/μl）	10 μl
7.	RNase Inhibitor（40 U/μl）	10 μl
8.	DEPC-treated water	400 μl
9.	RNase H（60 U/μl）	10 μl
10.	100 mM NaCl	10 ml
11.	精製カラム	10本
12.	2.0 ml チューブ	10本
13.	1.5 ml チューブ	10本

保存

(1)〜(9) −20℃
(10)〜(13) 室温

キット以外に必要な試薬類

●	解析を行う細胞由来のRNA（真核生物の場合polyA+RNAが望ましい） 真核生物の場合は0.5〜2 μgのpolyA+RNAもしくは10〜25 μgの全RNAを、原核生物の場合は5〜10 μgの全RNAを用いるのが標準的である。 TaKaRa DNAチップには、RNAは、2種類必要である。一方のRNAに対して、もう一方のRNAの発現差をDNAチップ解析により調べる。
●	1 mM Cy3-dUTP（Amersham Biosciences Code PA53022）
●	1 mM Cy5-dUTP（Amersham Biosciences Code PA55022）
●	100％ EtOH
●	70％ EtOH
●	滅菌蒸留水
●	クロロホルム／イソアミルアルコール（24：1）
●	3 M CH3COONa pH5.2
●	5×Carrier DNA（真核生物の場合に必要） それぞれ下記の最終濃度となるよう調製後、フェノール／クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿後、等量の滅菌蒸留水に溶解したものを用意する。 【ヒトサンプルの場合】 15 μg/μl　Human Cot I DNA（Invitrogen, 15279011） 5 μg/μl　Poly dA（Roche Diagnostics, 223581） 25 μg/μl　Yeast tRNA（SIGMA, R8759） 【マウスサンプルの場合】 15 μg/μl　Mouse Cot I DNA（Invitrogen, 18440016） 5 μg/μl　Poly dA（Roche Diagnostics, 223581） 25 μg/μl　Yeast tRNA（SIGMA, R8759）
●	ハイブリダイゼーションバッファー（6×SSC、0.2%SDS、5×Denhardt's溶液、0.1 mg/ml denatured salmon sperm DNA; 0.22 μmフィルターろ過済み）

蛍光標識反応を行う前の準備

A. 器具類
市販の滅菌ディスポーサブルプラスチック器具類は通常RNaseフリーと考えてよく、そのまま実験に用いてもさしつかえないが、マイクロ遠心チューブやマイクロピペット用チップなどはオートクレーブ処理を行った後用いる。ガラス器具、スパーテルなどを用いる場合には、160℃で少なくとも2時間以上乾熱滅菌を行う。乾熱滅菌できないものは、0.1％ ジエチルピロカーボネート（DEPC）溶液で37℃、12時間処理した後、オートクレーブ処理を行ってから（DEPCによるRNAのカルボキシメチル化を防ぐ）用いる。RNA実験用の器具類は他と明確に区別しておくことが必要である。また、RNaseが混入する最も大きな要因は、素手からの持ち込みなので、RNAを用いた実験を行う際には必ずプラスチック手袋とマスクを着用する。

B. 試薬類
試薬類は可能な限り0.1％ DEPC処理水で調製し、オートクレーブ処理を行ってから使用する。オートクレーブ処理ができない試薬が含まれている場合には、あらかじめ滅菌操作を行った器具類、水などを用いて溶液を調製し、ろ過滅菌後使用する。

RNAサンプルの調製

標識反応には純度の高いRNAサンプルを使用する。多糖や蛋白質などの不純物の混入により、標識反応が阻害される場合がある。また、ハイブリダイゼーション後のバックグラウンドが上昇したり、非特異的なシグナルが生じる可能性がある。さらに、DNAも逆転写酵素の鋳型となりうることから、ゲノムDNAの混入も防ぐ必要がある。

A. 全RNAの調製
塩化セシウム密度勾配遠心法やチオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルム法（AGPC法）、あるいは市販のRNA分離精製用の試薬、キットを用いること。

B. PolyA⁺RNAの精製
弊社取り扱いのOligotex-dT30<Super>（製品コード W9021）、あるいは Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit（製品コード 9086）を用いると、高純度なPolyA⁺RNAを全RNAから容易に回収することが可能である。

C.RNAの純度検定
ハイブリダイゼーションの結果は、用いるRNAの純度に大きく左右される。標識反応を行う前には、必ずRNAの純度検定を行う必要がある。

（1）	アガロースゲル電気泳動による検定
	1％ アガロースゲルを用いて、1〜2μgの熱変性を行なった全RNAを電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色を行なう。分解の起こっていない全RNAでは2本のribosomal RNA（真核細胞：28Sと18S、原核細胞：23Sと16S）のはっきりとしたバンドがおよそ2:1の割合でみられるが、ribosomal RNAのバンドが拡散している場合は、RNaseが混入している可能性があるので使用しないこと。また、28Sまたは23Sのバンドよりも分子量の大きいバンドがある場合は、ゲノムDNAの混入が考えられるのでDNase Iによる処理を行なってから標識反応に用いる。 この検定はアジレント2100バイオアナライザおよびRNA6000 Nano LabChipキット（製品コード 5065-4476）を用いるとより正確に行える。
（2）	吸光度による検定
	吸光度を測定し、A260/A280の比率が1.7以下のサンプルは使用しない方が望ましい。比率が1.8〜2.1のサンプルを使用する。

標識サンプルの確認

2倍のスケールで標識反応を行ない^*、1/2量をTestARRAY（製品コード X000）上でハイブリダイゼーションし、適度なシグナルが出ることで、標識サンプルの確認を行うことができる。
特に、はじめてDNAチップの実験を行う方には、まずTestARRAYでの確認を行い、一連の作業を習得した上で本実験を行うことをお勧めする。
* この時精製カラムは2本用いる。