small/micro RNAのNGS解析の品質検定に

ExiSEQ NGS sample QC kit

  • NGSライブラリー作製前にmicroRNA/small RNAのLNA qPCRによる検定が可能
  • プライマー分注済みのPCRパネルを使用した簡便なLNA qPCRアッセイ
  • NGS解析後の再現性や濃度直線性の評価にも使用可能な52種のSpike用RNA混合物
  • 生体液由来の低濃度RNAサンプルの評価に最適
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
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ベクター情報
参考
資料
EXQ 800101 E62101 ExiSEQ NGS sample QC kit – small RNA/microRNA (M)
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1 Kit ¥180,000
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EXQ 800102 E62102 ExiSEQ NGS sample QC kit – small RNA/microRNA (R)
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1 Kit ¥180,000
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EXQ 800103 E62103 ExiSEQ NGS sample QC kit – small RNA/microRNA (AF)
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1 Kit ¥135,000
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EXQ 800104 E62104 ExiSEQ NGS sample QC kit – small RNA/microRNA (RO)
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1 Kit ¥135,000
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EXQ 800105 E62105 ExiSEQ NGS sample QC kit – small RNA/microRNA (MI)
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1 Kit ¥135,000
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EXQ 800100 E62100 ExiSEQ NGS Spike-in kit - small RNA/microRNA
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1 Kit ¥92,000
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製品説明

ExiSEQ NGS Sample QC kit - small RNA/microRNAは、microRNA/small RNAのNGSライブラリー作製前のRNAサンプルの品質評価やNGS解析結果の検証を行うためのキットである。ExiSEQ NGS Sample QC kitは52種類の合成オリゴRNAとcDNA合成反応検証用のspike RNA (UniSp6)を含んでおり、それぞれRNA調製時、cDNA合成時に加えることで、各段階の検証を行うことができる。キットにはcDNA合成反応液と各種PCR装置に対応したプライマー分注済みのPCRパネルが含まれ、NGSライブラリ合成反応前の品質検定を迅速に行うことができる。
また、NGS解析後、投入された合成オリゴRNAのリード数を検証することで、NGS解析の再現性、濃度とリード数の直線性を検証することも可能である。
特に生体液由来のRNA低含量サンプルを解析する際には、従来方法では品質評価が困難なため、これらの検証を行うことが望ましい。

ExiSEQ NGS Sample QC kit
血漿・血清など生体液由来の微量のRNAは一般的に収量が少なく、その品質を検証することは困難である。しかしNGS解析には費用がかかるため、ライブラリー作製前にRNAサンプルの検証を行うことは非常に重要である。
ExiSEQ NGS Sample QC kit は52種類のSpike用合成RNAの混合物(ExiSEQ NGS Spike-ins)とUniSp6 RNAを含んでいる。これらをRNA調製、cDNA合成の際に添加し、NGSライブラリー作製前にLNA qPCRを行うことで、使用するRNA試料の品質や阻害物質の混入の検証を簡便に行うことができる。このキットにはcDNA合成用の試薬に加えて、プライマー分注済みの96ウェルプレート、384ウェルプレート(ExiSEQプレート)が含まれており、それぞれ24サンプル、48サンプルのLNA qPCRによる品質評価に使用できる。なお、qPCR用の試薬、ExiLENT SYBR Green Master mixはキットに含まれていないので別途購入する必要がある。
本キットでは、以下の評価が行える。
  • RNA精製効率
  • 精製RNA試料中のヌクレアーゼの混入
  • 精製RNA試料中の阻害物質の混入
  • 生体液中によく見られるmicroRNAの存在の検証
  • その他、異常サンプルの確認
  • (血清・血漿サンプルならば)溶血の有無

ExiSEQ NGS Spike-ins
広い濃度幅の52種類のmicroRNAを含む混合物であり、NGS解析後、各サンプル間のSpike RNAのリード数を確認することで、各サンプルの実験の再現性を評価できるほか、各RNAのリード数とその濃度を照らし合わせることで、濃度とリード数の直線性を検証することも可能である。
52種のExiSEQ NGS Spike-insの配列*1は、植物由来のmicroRNAに基づいており、ヒト(hsa)、マウス(mmu)、ラット(rno)、アカゲザル(mml)、オランウータン(ppy)、チンパンジー(ptr)、ブタ(ssc)由来のmicroRNAとは有意なホモロジーを示さない。したがって、これらの生物種のmicroRNA/small RNAのNGS解析に使用できるが、植物種のNGS解析の検証には適さない。

*1 配列リストはこちら
http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/ExiSEQ-NGS-QC-Spike-ins.fa

適応機種

384-well instrument coverage*2
M-typeApplied Biosystems 7900HT、 ViiA 7 Real-Time PCR system
Bio-Rad CFX 384 Real-Time PCR system
R-typeRoche LightCycler 480 Real-Time PCR system
96-well instrument coverage*3
AF-typeApplied Biosystems 7500 Fast, 7900 Fast, 7900HT Fast Real-Time PCR system
Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR system
Applied Biosystems ViiA 7 (FAST)
Applied Biosystems Quantstudio w. 96 well FAST block
RO-typeRoche LightCycler 480 Real-Time PCR system
MI-typeApplied Biosystems 7000, 7300, 7500, 7700 Real-Time PCR system
Applied Biosystems ViiA 7 (96-well Block)
Applied Biosystems Quantstudio w. 96 well std. block
BioRad iCycler, iQ4, iQ5, MyiQ, Chromo4
Eppendorf Mastercycler ep Realplex
Stratagene Mx4000 (after 2003)
*2 プレートレイアウトはこちら
http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/ExiSEQ-NGS-sample-QC-kit-Plate-layout-384well.xlsx *3 プレートレイアウトはこちら
http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/ExiSEQ-NGS-sample-QC-kit-Plate-layout-96well.xlsx

図1. ExiSEQ NGS sample QC kit – small RNA/microRNA
オレンジ色表示の試薬はキットに含まれている(ExiLENT SYBR Green Master mixを除く)。


表1. ExiSEQ プレートに含まれるmicroRNAのサンプル品質評価対象
qPCR assayRecommended usage
UniSp100RNA Isolation efficiency assessment
UniSp101RNA Isolation efficiency assessment
miR-103a-3pEndogenous control, serum/plasma
miR-191-5pEndogenous control, serum/plasma
miR-30c-5pEndogenous control, biofluids including urine
miR-451aHemolysis indicator serum/plasma
miR-23a-3pHemolysis indicator serum/plasma
UniSp6Monitoring presence of inhibitory compounds



図2. RNAサンプル品質の評価
LNA qPCR法によって内在性microRNAとRNA spike-insの存在量を調べサンプル品質を評価した。
溶血などにより異常値を示すサンプル(サンプル6と9)が明らかに判別できる。



図3. 溶血率の検証
サンプルの溶血率をモニターするために、赤血球特異的miR-451とコントロールmiR-23aを定量した。34の血漿サンプルのmiR-23aとmiR-451のLNA qPCRによるCq値の違い(ΔCq)を示す。ヒト血清または血漿においてΔCq(miR-23a -miR-451)が5以下の場合、非溶血サンプルと考えられる。ΔCq値が7以上かそれに近い場合、試料が溶血の影響を受けている可能性が高い。溶血率が高い場合、赤血球由来のmicroRNAにより、解析されたmicroRNAのプロファイルに赤血球由来のmicroRNAが大きな影響を与えていると考えられる。そのため、そのようなサンプルのNGS解析では特別の注意が必要である。



図4. 血漿由来RNAのmicroRNAシーケンスの再現性
同一の血漿サンプルからRNA抽出、ライブラリー作製、シーケンスを2連で行った。RNA精製中に加えられた52種のExiSEQ NGS Spike-insのリード数については、非常に再現性の良い結果が得られた。
TPM = Tags per Million mapped reads

内容

ExiSEQ NGS Sample QC kit - small RNA/microRNA(製品コード 800101~800105)
・Enzyme mix
・5× Reaction buffer
・Nuclease-free water
・384 well plateまたは96 well plate
 (製品コード 800101、800102には384 well plateが1枚含まれており、48サンプル解析可能。
  製品コード 800103、800104、800105には98 well plateが2枚含まれており、2×12サンプル解析可能)
・UniSp6, RNA spike-in
・ExiSEQ NGS Spike-ins, 52 5’ phosphorylated RNA molecules

ExiSEQ NGS spike-ins(500サンプル分)(製品コード 800100)
・ExiSEQ NGS Spike-ins, 52 5’ phosphorylated RNA molecules
・Nuclease-free water 1 ml

保存

-20℃

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

試薬
・ExiLENT SYBR Green master mix(製品コード 203401、203403)
・RNA 抽出キット(miRCURY RNA Isolation Kit等)
器具
・マイクロ遠心機
・ピペット、ピペットチップ
・ボルテックスミキサー
・ヒートブロック
・リアルタイムPCR装置

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