LNA™ microRNA Mimic

  • 3本のRNA鎖より構成される独自設計のmicroRNA Mimic
  • passenger鎖に2本のLNA修飾RNAを用いてオフターゲット効果を効果的に抑制
  • guide鎖は非修飾の成熟microRNA配列なので細胞内で効率よくRISC複合体を形成
  • FAMまたはビオチン標識タイプも利用可能
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
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製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
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資料
EXQ E71001 miRCURY LNA™ microRNA Mimic
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5 nmol ¥58,000
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EXQ E71002 miRCURY LNA™ microRNA Mimic
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20 nmol ¥178,000
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EXQ 479995-011 E71009 miRCURY LNA™ microRNA Mimic, FAM
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5 nmol 終売 終売日:2017/10
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EXQ 479995-014 E71010 miRCURY LNA™ microRNA Mimic, FAM
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20 nmol 終売 終売日:2017/10
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EXQ E71013 miRCURY LNA™ microRNA Mimic, Premium, FAM
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5 nmol ¥78,000
旧製品コード 479997-611 説明書・データシート・ベクター情報
EXQ E71014 miRCURY LNA™ microRNA Mimic, Premium, FAM
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20 nmol ¥216,000
旧製品コード 479997-614 説明書・データシート・ベクター情報
EXQ E71015 miRCURY LNA™ microRNA Mimic, Premium, Biotin
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5 nmol ¥78,000
旧製品コード 479997-671 説明書・データシート・ベクター情報
EXQ E71016 miRCURY LNA™ microRNA Mimic, Premium, Biotin
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20 nmol ¥216,000
旧製品コード 479997-674 説明書・データシート・ベクター情報

★下記のご注文方法をご確認下さい。

製品説明

miRCURY LNA microRNA Mimicは、天然に存在する成熟microRNAを模して設計された合成二本鎖RNAで、細胞内へ導入されるとRISC複合体に取り込まれて天然のmicroRNAと同様の機能を示します。RISC複合体の増加によって細胞に生じる変化を調べることにより、目的microRNAの機能を知ることが可能となります。miRCURY LNA microRNA MimicにはmiRBaseに登録されているヒト、マウスおよびラットのmicroRNAの大部分をカバーする設計済みのmiRNA Mimicが用意されています。製品は、脱塩、乾燥状態で供給されるため、溶解後すぐにトランスフェクションやエレクトロポレーションに使用できます。
ネガティブコントロールにはmiRCURY LNA microRNA Mimic Controlをご利用ください。

LNA microRNA Mimicは4種類から選択できます。
製品名 修飾タイプ 精製方法 製品コード
miRCURY LNA microRNA Mimic
なし
guide鎖:脱塩
passenger鎖:脱塩
Exiqon社Webサイト参照
miRCURY LNA microRNA Mimic, FAM
FAM
479995-011, -014
miRCURY LNA microRNA Mimic, Premium, FAM
FAM
guide鎖:NaIE-HPLC
passenger鎖:脱塩
479997-611, -614
miRCURY LNA microRNA Mimic, Premium, Biotin
Biotin
479997-671, -674

独自の構造を持つLNA microRNA Mimic

miRCURY LNA microRNA Mimicは3本のRNA鎖より構成されます。本製品は、miRBaseに登録されたmicroRNA鎖と全く同じ配列で非修飾のguide鎖と、それと相補的な配列を2本に分割してLNA修飾したRNA鎖であるpassenger鎖よりなります(図1)。passenger鎖が分断されているため、RISC複合体に取り込まれる成熟microRNA(guide鎖)のみがmicroRNA活性を示し、passenger鎖によるオフターゲット効果が極めて低く抑えられています(図2)。また、passenger鎖のLNA修飾パターンは、guide鎖が効率的にRISC複合体に取り込まれるように最適化されています。

RNA鎖
図1. miRCURY LNA microRNA Mimicは3本のRNA鎖から構成される
miRCURY LNA microRNA Mimicは、非修飾の成熟microRNA全長(guide鎖)とそれに相補的で2本に分割されたLNA修飾RNA鎖(passenger鎖)から構成される。guide鎖だけがRISCに取り込まれ、passenger鎖は2本に分割されているためmicroRNAとして作用せずguide鎖から離れた後、速やかに分解される。
FAM修飾タイプのMimicは、passenger鎖の5’末端が蛍光標識されている。ビオチン標識タイプのMimicは、guide鎖の3’末端にビオチンが修飾されている。


microRNA様作用
図2. 独自のmiRCURY LNA microRNA Mimicの構造が特異的なmicroRNA様作用を起こす
miRCURY LNA microRNA Mimicのpassenger鎖は、2本の短いpassenger鎖に分断されているため、microRNAとして非機能的である。さらにguide鎖から分離後すぐに分解されるため、guide鎖の成熟microRNA鎖のみがRISC複合体へ取り込まれる。そのため、passenger鎖によるオフターゲット効果が最小限に抑えられている。

LNA技術の利用

3本のRNA鎖から構成される独自のmicroRNA Mimicの設計は、2本に分割された短いpassenger鎖のそれぞれにLNA技術を用いることで可能になりました。配列と鎖長、LNAの修飾パターンが、Exiqon社の長年のLNA使用経験による高度なアルゴリズムにより最適化されています。
microRNAレポーターのサイレンシング
図3. miRCURY LNA microRNA Mimicによるサイレンシング
ホタルルシフェラーゼ遺伝子の3'UTRにmicroRNA配列(hsa-miR-15b-5pまたはhsa-miR-20a-5p)のターゲット配列を挿入したmicroRNAレポータープラスミドを用意し、HeLa細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション効率をノーマライズするために、トランスフェクション時にウミシイタケルシフェラーゼを同時に導入した。翌日、ターゲット配列に応じたmiRCURY LNA microRNA Mimicとcel-miR-39-3p、ネガティブコントロールをそれぞれ4段階の濃度でトランスフェクションし、24時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。ホタルルシフェラーゼ/ウミシイタケルシフェラーゼの活性比は、pLuc(microRNAターゲット配列を導入していないコントロールベクター)の値を用いてノーマライズした。pmiR-15b、pmiR-20aは内在性microRNAによって抑制された活性レベルを示している。
miRCURY LNA microRNA Mimicの使用によって、ホタルルシフェラーゼの発現量は内在性microRNAの抑制レベルより更に減少しており、適切なトランスフェクション条件下でのmiRCURY LNA microRNA Mimicの効果が示された。

microRNAレポーターのサイレンシング
図4. miRCURY LNA microRNA Mimicの配列特異性
ルシフェラーゼ遺伝子の3’UTRにhsa-miR-16-3p(上図)またはhsa-miR-16-5p(下図)のターゲット配列を挿入したmicroRNAレポータープラスミドを用いてHeLa細胞のトランスフェクションを行った。更に、それぞれに対応するmiRCURY LNA microRNA Mimic、またはネガティブコントロール(cel-miR-39-3p)を導入した。ルシフェラーゼアッセイの結果、それぞれmicroRNAレポータープラスミドに対応するMimicを導入した細胞においてのみ、特異的に活性抑制が見られた。

蛍光標識microRNA Mimic

蛍光標識microRNA Mimicはトランスフェクション効率を検証するために使用します。
microRNA鎖(guide鎖)を蛍光標識するとMimicとしての機能は完全に失われますが、本製品ではpassenger鎖の5’末端が蛍光標識されているため、Mimic由来のmicroRNA活性には影響を及ぼしません(図5)。なお、guide鎖は蛍光標識されていないため、細胞内でのmicroRNA(guide鎖)の局在性モニタリングには使用できません。

蛍光標識microRNA Mimic
図5.蛍光標識microRNA Mimic
hsa- miR-1-3p配列を持つルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むHeLa細胞にhsa-miR-1-3pの蛍光標識Mimicまたは非標識Mimicをトランスフェクションした。ネガティブコントロールとしてcel-miR-39-3p Mimicを使用した。ルシフェラーゼ活性は非標識Mimicと同様に蛍光標識Mimicでも効率良く抑制された。

ビオチン標識microRNA Mimic

ビオチン標識microRNA Mimicは、RNAプルダウン法においてmicroRNAターゲットを非常に効果的に同定するために利用できるツールです。本法により、非定型的microRNA-mRNA相互作用を明らかにできる可能性があります。
通常Mimic中のmicroRNA(guide鎖)の5’または3’末端を修飾すると、microRNAとして全く機能しなくなると考えられています。しかし、Exiqon社のビオチン標識Mimicは非修飾のものと比較すると活性レベルは低いが、明らかなmicroRNA活性を有しています(図6)。標識による活性低下は、おそらくRISCへの取込効率の低下の結果と考えられます。そのためguide鎖のみが確実にRISCによって選択され取込まれるMimicを使用することが重要になります。miRCURY LNA microRNA Mimicはpassenger鎖が2つに分割された独自の構造を採用しており、guide鎖の特性を維持しています。
RNAプルダウン法の詳細はこちらをご確認ください。

ビオチン化microRNA Mimicを用いたレポーターアッセイ
図6.ビオチン標識microRNA Mimicを用いたレポーターアッセイ
HeLa細胞に3’-UTRにhsa-miR-1-3p 相補配列を持つFireflyルシフェラーゼレポーター遺伝子(pmiR-1) とRenillaルシフェラーゼをそれぞれ持つプラスミドを同時トランスフェクションした。その後、各濃度のhsa-miR-1-3p microRNA MimicまたはcelmiR-39-3pネガティブコントロールを導入した。24時間後にレポーター遺伝子発現を測定した。Renilla活性に対するFireflyルシフェラーゼ活性比を表している。ビオチン標識していないMimicよりも1/50程度であるが、ビオチン標識MimicでもmicroRNA活性を有していることがわかる。

ビオチン化MimicによるmicroRNAターゲットの探索
図7.ビオチン標識MimicによるmicroRNAターゲットの探索
ビオチン標識microRNA Mimicをトランスフェクションによって細胞へ導入する。24時間後に細胞を集めて溶解し、ビオチン標識RISCとmRNAの複合体をストレプトアビジン磁性ビーズにより沈降させる。洗浄後、回収RNAを精製し、マイクロアレイ、RT-qPCR、次世代シーケンスなどによって解析することができる。

ご注文方法

1. LNA Mimic 非修飾タイプのご注文方法


2. LNA Mimic FAM/Biotin 修飾タイプのご注文方法


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専用注文書

内容

5 nmolまたは20 nmol(乾燥品)

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