タンパク質定量アッセイ(ProLabel™ Assay)

  • レポータータグを利用した簡便で迅速かつ高感度な定量アッセイ
  • 目的タンパク質のN末あるいはC末に6 kDaの小さなタグを融合して発現
  • 多検体アッセイにも有用
  • ブロッティングは不要
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 631628 Z1628N ProLabel™ Quantitative Expression Vector Set
  • ライセンス
10 μg×2 ¥64,900
説明書・データシート・ベクター情報
ProLabelベースの化学発光アッセイは細胞ライセート中の目的タンパク質の検出と測定に非常に便利である(図1)(1)。目的タンパク質の機能が未知の場合でも、問題なくアッセイが可能である。ProLabel Quantitative Expression Vector Setは、目的タンパク質のN末端またはC末端にProLabelタグを融合して発現させることができる。ProLabelアッセイは、共免疫沈降によるタンパク質相互作用やRNAiによるノックダウンを含め、さまざまなProLabel融合タンパク質を用いたアッセイ系の確立を可能にする。

本キットは以下の用途に有用である。
  • 目的タンパク質発現のモニターと定量(図1)
  • 共免疫沈降によるタンパク質相互作用の検出(図2)
  • RNAi研究でのshRNAやsiRNAによるノックダウンの測定
  • HTPアッセイ
  •  など

ProLabelアッセイの原理

ProLabelアッセイは酵素(β-ガラクトシダーゼ)断片コンプリメンテーションアッセイの1種であり(2、3)、レポータータンパク質が2つの機能のない断片、すなわちProLabelと呼ばれる小フラグメントとEnzyme Acceptorと呼ばれる大フラグメントに分けられている。ProLabelタグは目的タンパク質と融合したN末端タグまたはC末端タグとして発現される(図1)。ProLabelタグとDetection Kitから供給されるEnzyme Acceptor(EA)が会合し、完全な活性型酵素を形成して初めて、化学発光基質を開裂する。その結果得られるシグナルは標準的なルミノメーターで定量検出が可能である。
ProLabelアッセイは高感度であるため、ライセート中の目的タンパク質発現レベルを短時間で測定できる。また検出下限が低く、優れたダイナミックレンジを有しているため、タンパク質発現レベルのわずかな変化も容易に検出することができる。


図1. ProLabelスクリーニングアッセイを用いると、あらゆる組換えタンパク質の発現レベルを定量的に測定可能
目的タンパク質のProLabelタグがβ-ガラクトシダーゼのΩ断片(酵素アクセプター[EA])を補完する。これらのタンパク質断片が一つになって活性型酵素を形成し、これが化学発光基質を切断してシグナルを発する。このシグナルは標準的なルミノメーターを使って検出することができる。

ProLabelシステムの特長

・6 kDaの小さなProLabelタグを利用している。
・タグ配列が単独で発現すると短時間で分解されるため、本システムのバックグラウンド発現は非常に低いレベルである。
・細胞ライセートでのアッセイが可能であり、簡単かつ迅速に結果が得られる。
・ハイスループットな系にも最適である。


図2. ProLabelタグによる共免疫沈降法
SV40Tとp53は強く相互作用し、SV40Tとラミンは特異的な相互作用はしない。これらのタンパク質間相互作用を共免疫沈降法により解析した。
HEK 293細胞に、ProLabelタグ融合SV40T発現用プラスミド、およびAcGFP1とラミンまたはp53の融合発現プラスミドをコトランスフェクトした。コトランスフェクトした細胞から調製したライセートをAcGFP1抗体を用いて免疫沈降し、洗浄後の共免疫沈降した複合体をProLabel Detection Kit II(終売)を用いて分析し、ProLabel活性を測定した。
SV40T = SV40ラージT抗原、Lam = ラミン(1、3)



図3. ProLabelアッセイによるRNAi遺伝子抑制レベルの測定
19種類の遺伝子についてProLabel融合タンパク質を発現するためのベクターを用意した。各遺伝子に対するshRNA発現カセット(Knockout RNAi Clone & Confirmキットを使って作製)を、各ProLabel融合コンストラクトと同時にHEK 293細胞に導入した。ノックダウン効率(%)はProLabel Detection Kit II(終売)を用いて測定した(1)。

内容

ProLabel Quantitative Expression Vector Set
(製品コード 631628)
・pProLabel-C Vector
・pProLabel-N Vector

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-20℃

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