Lentiviral High Titer Packaging Mix with pLVSINシリーズ

  • 高力価のレンチウイルスベクター調製のためにパッケージング機能を最適化
  • VSV-Gエンベロープにより広範囲な細胞種に導入可能
  • ウイルス遺伝子の分割導入により、複製能を欠く安全な組換えレンチウイルスを産生
  • 3'LTR/ΔU3のpLVSINベクターと組み合わせてP2実験が可能(注:挿入遺伝子による)

メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR 6194 6194 Lentiviral High Titer Packaging Mix
60回 ¥174,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 6950 6950 Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-CMV Neo Vector)
  • ライセンス
1 Set ¥225,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 6951 6951 Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-CMV Hyg Vector)
  • ライセンス
1 Set ¥225,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 6952 6952 Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-CMV Pur Vector)
  • ライセンス
1 Set ¥225,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 6953 6953 Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-EF1αNeo Vector)
  • ライセンス
1 Set ¥225,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 6954 6954 Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-EF1αHyg Vector)
  • ライセンス
1 Set ¥225,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 6955 6955 Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-EF1αPur Vector)
  • ライセンス
1 Set ¥225,000
説明書・データシート・ベクター情報

実験操作動画はこちら

製品説明

Lentiviral High Titer Packaging Mixは、レンチウイルスベクター調製に必要なコンポーネントを発現するプラスミドを最適な比率で混合し、コンポーネントを最適な比率で発現するよう設計することで、高力価のレンチウイルスベクターを得ることを可能にした製品である。導入したいpLVSINレンチウイルスベクタープラスミドとPackaging MixをLenti-X 293T細胞(Lenti-X 293T Cell Line 製品コード 632180)にコトランスフェクトすることで、Packaging MixよりHIV-1由来のGag、Pol、Tat、Revのレンチウイルスタンパク質と、VSV-Gエンベロープタンパク質が一過性に発現される。そして、pLVSINレンチウイルスベクタープラスミドから転写された組換えウイルスRNAは完全なウイルス粒子の中に取り込まれる(図1)。この最適化されたPackaging MixとLenti-X 293T細胞、さらに高効率トランスフェクション試薬TransIT-293 Transfection Reagent(製品コード MIR2700)の組み合わせにより、高いウイルス力価を有するレンチウイルスベクター液を取得することができ、多くの場合、取得したレンチウイルスベクター液を濃縮することなく、直接、標的細胞の感染に使用できる。

Lentiviral High Titer Packaging Mix とLenti-X 293T 細胞を用いたレンチウイルスの産生
図1.Lentiviral High Titer Packaging MixとLenti-X 293T細胞を用いたレンチウイルスの産生
Lentiviral High Titer Packaging Mixと目的遺伝子を挿入したpLVSINレンチウイルスベクタープラスミドをコトランスフェクトする(ステップ1)と、対応する組換えレンチウイルスゲノムRNA転写物とウイルスパッケージングタンパク質が産生される(ステップ2)。
組換えウイルスRNAゲノム上のパッケージング配列(Ψ)がパッケージングタンパク質に認識されると(ステップ3)、組換えウイルスRNAゲノムがパッケージングタンパク質に取り込まれてウイルスコアが形成され、コアが細胞膜に輸送される(ステップ4)。その場所で、コアはVSV-Gエンベロープタンパク質を含む細胞膜によって包まれる。成熟した感染性のビリオン(ウイルス粒子)が細胞から出芽し(ステップ5)、培地中に放出される。培地からウイルス粒子を回収する(ステップ6)。
ウイルス粒子は感染力があるが、標的細胞内での複製・増殖に必要ないくつかの遺伝子を欠いている。ウイルスタンパク質を発現するのに必要なプラスミドを複数用いているため、頻度の低い組換えが何度も起こらないと、複製能をもつウイルスは生成しない。その意味で、この方法は非常に安全なウイルス生産法といえる。

内容

Lentiviral High Titer Packaging Mix(製品コード 6194)
Lentiviral High Titer Packaging Mix 60回(140 μl×3)     ※100 mm dish 使用の場合の回数です

Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-CMV Neo Vector)(製品コード 6950)
Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-CMV Hyg Vector)(製品コード 6951)
Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-CMV Pur Vector)(製品コード 6952)
Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-EF1α Neo Vector)(製品コード 6953)
Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-EF1α Hyg Vector)(製品コード 6954)
Lentiviral High Titer Packaging Mix (pLVSIN-EF1α Pur Vector)(製品コード 6955)


製品コード 6950~6955は、Lentiviral High Titer Packaging Mix(製品コード 6194)
と各pLVSIN Vector(製品コード 6181~6186)のセットです。

pLVSIN-CMV DNAベクターマップ

ベクター鎖長利用可能な制限酵素サイト(MCS)
pLVSIN-CMV Neo7,809 bpEcoR I, Xho I, Xba I, Not I, BamH I
pLVSIN-CMV Hyg8,049 bpXho I, Xba I, Not I, BamH I
pLVSIN-CMV Pur7,614 bpEcoR I, Xho I, Xba I, Not I, BamH I
pLVSIN-EF1α Neo8,386 bpSse8387 I, Smi I, Xba I, Not I, BamH I
pLVSIN-EF1α Hyg8,626 bpSse8387 I, Smi I, Xba I, Not I, BamH I
pLVSIN-EF1α Pur8,191 bpSse8387 I, Smi I, Xba I, Not I, BamH I

DNAシーケンスデーター

その他必要な試薬など

  1. パッケージング細胞

  2. 試薬類
    ・下記のうちいずれかのトランスフェクション試薬*1
    pLVSIN-AcGFP1-N1 Vecter(ポジティブコントロール用:製品コード 6187)*2
    *1 aは安定して高力価のレンチウイルスを取得するのに適しており、bは比較的安価にトランスフェクションを行うことができる。本製品を使用して高力価のレンチウイルスを取得するにはTransIT-293 Transfection Reagentの使用を強く推奨する。
    *2 pLVSIN-AcGFP1-N1 Vecterは蛍光タンパク質であるAcGFP1を発現するレンチウイルスベクタープラスミドであり、トランスフェクション効率の確認や、調製したレンチウイルスの生物学的力価を確認するためのポジティブコントロールとして使用するのに便利である。

  3. 力価測定
    正確で再現性のある遺伝子導入のために、レンチウイルスストック液の力価測定を強く推奨する。Lenti-X qRT-PCR Titration Kit(製品コード 631235)は、qRT-PCRを利用した迅速・簡便な力価測定キットである(Clontechniques , January 2008; Quinn et al ., 1997)。本キットではSYBR Green I検出リアルタイムPCRによりウイルスRNAゲノムの存在量(RNAタイター)を調べることで、ウイルスストック液の力価を約4時間で測定できる。Lenti-X p24 Rapid Titer Kit(製品コード 632200)では、ELISA法を用いてウイルス上清中のp24キャプシドタンパク質の量を測定する。測定したp24キャプシドタンパク質量はウイルス力価と相関する。
    また、Lenti-X GoStix(製品コード 631243/631244)を用いると、ウイルス上清20 μlを使用して最短30秒(~10分)でレンチウイルスp24を検出してウイルス力価を簡易判定できます。ウイルス上清を回収するか、まだ培養を続けるかを判断するために有用である。

  4. 組換えレンチウイルスの精製
    ウイルスを精製することで、遺伝子導入実験に悪影響を及ぼすおそれがある細胞夾雑物を除去することができる。Lenti-X Maxi Purification Kit(製品コード 631233/631234)は、クルードな上清から高純度レンチウイルスを精製するためのキットで、自然落下カラムを用いたプロトコールにより、インタクトで機能的なレンチウイルスを簡単、迅速、高効率で得ることができる。

  5. 組換えレンチウイルスの濃縮
    Lenti-X Concentrator(製品コード 631231/631232)を用いると、超遠心を行わずにウイルス力価を100倍まで濃縮できる。濃縮されたレンチウイルスは高いMOIで標的細胞に感染できるため、さらにレンチウイルスを調製する必要はない。

  6. 組換えレンチウイルスの感染効率アップ
    RetroNectin (Recombinant Human Fibronectin Fragment)(製品コード T100A/B)は組換えフィブロネクチン断片(CH-296)で、レトロウイルスやレンチウイルスによる遺伝子導入効率を大きく向上させることができる(Clontechniques , October 2008)。RetroNectinは、組織培養プレート(ノントリートメント)にコーティングすることで、ウイルスと細胞の両方が結合する基質(substratum)となる。この基質にウイルスと細胞が同時に接着することにより、細胞とウイルスの接触が増大し、遺伝子導入が促進される。RetroNectinは、特に浮遊細胞(リンパ球やリンパ球細胞株など)や遺伝子導入が困難な細胞(造血幹細胞など)、あるいはポリブレンに特に弱い細胞に有用である。

実験操作動画 【レンチウイルスのパッケージング】

本製品を使用する一連の実験操作を、解説付きの動画でご覧いただけます。

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-20℃

使用上の注意

  • 本製品の使用には遺伝子工学と細胞培養に関する基本的な技術が必要です。
  • 本製品の使用には文部科学省の定める省令(「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16年文部科学省・環境省令第1号)にあるP2レベル以上の施設が必要です。(→説明書の「バイオセーフティーについて」を参照してください。)
  • 本レンチウイルスベクターの系によって生産されるウイルス上清は、挿入断片によっては危険なウイルスを含む恐れがあるため、組換えレンチウイルスの生産と取扱いには、適切な処置をとる必要があります。吸入や付着を防ぐため、必ず、安全キャビネットを使用してください。
  • 本製品の使用はすべて研究用に限定されています。臨床目的での使用および生体外診断に使用することはできません。
  • 本製品ご利用の際は省令および組織内の組換えDNA安全委員会の指示に従い、安全には十分ご注意下さい。
  • 本製品の使用によって生じたいかなる事故、損害についても、弊社では責任を負いかねますので、ご了承の上ご使用下さい。
  • 本製品を工業的に使用される場合は、個別にライセンス契約の締結が必要です。
  • タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。
  • ライセンスに関する情報は弊社ウェブカタログをご覧ください。
  • RetroNectinはタカラバイオ株式会社の、In-FusionはTakara Bio USA, Inc.の、SYBRはMolecular Probes, Incの登録商標です。Lenti-X、CalPhos、GoStixはTakara Bio USA, Inc.の商標です。その他、会社名および商品名などは、各社の商号、または登録済みもしくは未登録の商標であり、これらは各所有者に帰属します。

関連資料

遺伝子導入実験ハンドブック

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