βガラクトシダーゼ遺伝子搭載AAVベクタ―の作製

AAVpro® Helper Free System (AAV-LacZ)

  • ヘルパーウイルスを使用せずに、安全にβガラクトシダーゼ遺伝子を搭載した血清型1、2、5、6の
    アデノ随伴ウイルスベクター(AAV1、AAV2、AAV5、AAV6ベクター)を作製
  • in vitroin vivoにおいて遺伝子導入のコントロールに最適

パンフレットもご覧ください。
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
TKR 6669 6669 AAVpro® Helper Free System (AAV1-LacZ)
  • ライセンス
1 Kit ¥150,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 6655 6655 AAVpro® Helper Free System (AAV2-LacZ)
  • ライセンス
1 Kit ¥150,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 6656 6656 AAVpro® Helper Free System (AAV5-LacZ)
  • ライセンス
1 Kit ¥150,000
説明書・データシート・ベクター情報
TKR 6657 6657 AAVpro® Helper Free System (AAV6-LacZ)
  • ライセンス
1 Kit ¥150,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

アデノ随伴ウイルス(Adeno Associated Virus:AAV)は、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下で増殖する非エンベロープウイルスである。アデノ随伴ウイルスベクター(AAVベクター)は文部科学省の定める省令(「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16年文部科学省・環境省令第1号)にあるP1レベルの施設で取扱いが可能であり、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターと比較して、安全で取扱いの容易なウイルスベクターとして知られている。AAVベクターは増殖/非増殖のいずれの細胞にも遺伝子導入が可能であり、特に非分裂細胞においては長期間の発現が可能である。また、免疫原性が低く、動物個体への遺伝子導入にも適している。

AAVには100を超える血清型が存在しており、血清型の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られている。血清型2(AAV2)は古くから広く研究されてきた血清型の1つであり、宿主域が大変広いという特長を持っている。血清型1(AAV1)、血清型5(AAV5)、血清型6(AAV6)は、より高い組織指向性を持った血清型である。AAV1は筋肉、肝臓、気道、中枢神経系等、AAV5は中枢神経系、肝臓、網膜等、AAV6は心臓、筋肉、肝臓等への遺伝子導入効率が高いと言われている。

本製品は、βガラクトシダーゼ遺伝子搭載の血清型1、2、5、6のAAVベクターを、ヘルパーウイルスを使用せずに安全に作製するためのキットである。調製されたAAV LacZベクターはin vitro /in vivoにおいて、遺伝子導入のコントロールベクターとして使用することができる。
AAV2-LacZ感染細胞のX-gal染色結果
図1.AAV2-LacZ感染細胞のX-gal染色結果
AAVpro Helper Free Ssytem(AAV2-LacZ)を用いて調製したAAV2-LacZベクターをAAVpro Purifcation Kit(AAV2)を用いて精製し、HT1080細胞に感染させた。Beta-Galactosidase Staining kitを用いて染色を行い、感染を確認した。

AAVベクター作製の概要

AAV Helper Free Systemはヘルパーウイルスを使用せずに高タイターなAAVベクターを作製する独自のシステムである(図2)。本製品では、AAVベクターの作製に必要な複数のプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションすることで、簡便にAAVベクターを作製することができる。ここで必要なコンポーネントは、以下の3種類のプラスミドである。

・pAAV-LacZ Vector  βガラクトシダーゼ遺伝子と2つのITRを含むベクタープラスミド
・pRC Vector  AAV2のRep遺伝子および各血清型のCap遺伝子を含むパッケージングプラスミド
・pHelper Vector アデノウイルス由来のE2A、E4、VAを含むパッケージングプラスミド

さらに、従来の凍結融解法や超音波破砕法ではなく、タカラバイオが独自に開発したAAV Extraction Solutionを用いて、AAVベクター産生細胞からベクターを調製することにより、宿主由来のタンパク質や核酸の混入を抑え、効率的かつ簡便にAAVベクターを抽出することができる。抽出試薬はAAVpro Extraction Solution(製品コード 6235)としても販売している。また、AAVベクターの精製は、AAVpro Purification Kit (All Serotypes)(製品コード 6666)AAVpro Purification Kit (AAV2)(製品コード 6232:血清型2のAAVベクターに対応)を用いて行うことができる。

AAVpro Helper Free SystemによるAAVベクター作製
図2.AAVpro Helper Free SystemによるAAVベクター作製

内容

各システムには3種類のプラスミドとAAVベクター産生細胞からのベクター抽出に必要な2種類の試薬が含まれている。

AAVpro Helper Free System (AAV2-LacZ)(製品コード 6655)の場合
1.pAAV-LacZ Vector(1 μg/μl)20 μl
2.pRC2-mi342 Vector(1 μg/μl)*120 μl
3.pHelper Vector(1 μg/μl)20 μl
4.AAV Extraction Solution A1.5 ml×3本
5.AAV Extraction Solution B150 μl×3本
*1AAVpro Helper Free System (AAV1-LacZ)(製品コード 6669)ではpRC1 Vector、AAVpro Helper Free System (AAV5-LacZ)(製品コード 6656)ではpRC5 Vector、AAVpro Helper Free System (AAV6-LacZ)(製品コード 6657)ではpRC6 Vectorである。

各ベクターのシーケンスデータ

保存

-20℃
ただし、AAV Extraction Solution AおよびAAV Extraction Solution Bは融解後、室温保存

キット以外に必要な主な器具・試薬

  1. 器具・装置
    ・細胞培養に必要な一般的設備
    ・100 mmφ細胞培養用表面処理ディッシュ
  2. 試薬類
    ・下記のうちいずれかのトランスフェクション試薬
    ・ Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM) 4.5 g/l Glucose with L-Glutamine(584 mg/l)
    ・ Fetal Bovine Serum(FBS)
    ・ Trypsin EDTA
    ・ HEK293もしくはHEK293T細胞[AAVpro 293T Cell Line (製品コード 632273)
    ・ 0.5 M EDTA(pH8.0)[EDTA Buffer Powder, pH8.0(製品コード T9191)
    pAAV-ZsGreen1 Vector(製品コード 6231:ポジティブコントロール用)

大量作成を行う場合

動物個体への遺伝子導入のためにAAVベクターを大量作製する場合は、高容量トランスフェクション用プラスミドセット AAVpro Packaging Plasmid (AAV1)(製品コード 6672)AAVpro Packaging Plasmid (AAV2)(製品コード 6234)AAVpro Packaging Plasmid (AAV5)(製品コード 6664)AAVpro Packaging Plasmid (AAV6)(製品コード 6665)が便利である。

使用上の注意

本製品をご利用の際は、以下の点にご注意ください。
  • 本製品の使用には文部科学省の定める省令(「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16年文部科学省・環境省令第1号)にあるP1レベル以上の施設が必要です。
  • 本製品ご利用の際は省令および組織内の組換えDNA実験安全委員会の指示に従い、安全には十分ご注意ください。
  • 本アデノ随伴ウイルスベクターの系によって生産されるウイルスは挿入断片によっては危険なウイルスを含む恐れがあるため、組換えアデノ随伴ウイルスベクターの生産と取扱いには、適切な処置をとる必要があります。吸入や付着を防ぐため、必ず、安全キャビネットを使用してください。
  • 本製品の使用には遺伝子工学と細胞培養に関する基本的な技術が必要です。

関連資料

遺伝子導入実験ハンドブック

ダウンロード(3.85 MB)

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注意事項
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