製品説明
毒素原性大腸菌（ETEC）は、耐熱性エンテロトキシン（ST）または易熱（イネツ）性エンテロトキシン（LT）と呼ばれる毒素の両方またはいずれか一方を産生する大腸菌で、1960年代後半～70年代に明らかにされた菌である。ETECの検出において、これらの毒素の産生能力の有無を的確に、かつ迅速にチェックする検査方法が望まれている。
本製品はETECによる食中毒の原因遺伝子である易熱性エンテロトキシン遺伝子（LT gene）をPCR法で簡便かつ迅速に検出を行うためのOne Shot PCR Kitである。
PCRに必要な試薬すべてが0.2 ml PCR tubeに分注されており、サンプルをチューブに添加するだけでPCR反応を開始することができる。また、DNAポリメラーゼに従来のTaqより増幅効率の優れたTaKaRa Ex Taq HSを採用しており、より短時間で高感度の検出が可能になった。さらに、反応阻害などによる偽陰性判定を防ぐためのインターナルコントロールDNAが含まれている。このインターナルコントロールDNA由来の増幅産物は、LT遺伝子由来の増幅産物とサイズが大きく異なるので、電気泳動による判定を確実に行うことができる。
内容
（48回分、50 μl反応系）
2×One Shot PCR solution tube（無色の 0.2 ml PCR tube） 25 μl×48本
【 2×One Shot PCR solutionに含有されているもの 】
- Primer Set ELT-1 ＆ 2
（標的遺伝子）易熱性エンテロトキシン（LT）遺伝子を増幅検出する。
（増幅サイズ）263 bp
- インターナルコントロールDNA
（増幅サイズ）690 bp
ターゲット遺伝子とは異なる配列を有するDNA分子で、偽陰性の判定を目的としている。すべての反応系に存在させることで、ターゲットが不検出の場合、インターナルコントロールDNAの検出ができていれば、PCR反応阻害が起こらず検出限界以下と判定できる。ターゲット、インターナルコントロールDNAともに不検出の場合はPCR反応が正常に進まなかったことがわかる。なお、ターゲットのDNA量が多い場合、そのターゲットの増幅反応が優先され、インターナルコントロールDNAの検出ができないことがある。この場合、ターゲット遺伝子が正しく検出されていれば、陽性であると判定できる。
単品販売している特殊細菌検出用Positive Control Template EC1（製品コード S032）を用いた場合と同じサイズの増幅産物が得られる。
- TaKaRa Ex Taq HS
TaKaRa Ex Taq HSは、抗Taq抗体とTaKaRa Ex Taqを混合したもので、ホットスタートPCR用の酵素である。高温に加熱するまでは抗Taq抗体が酵素に結合し、ポリメラーゼ活性を抑えているため、サイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する非特異的増幅を防ぐことができる。
- Ex Taq Buffer
- dNTP Mixture
保存
－20℃
各チューブには、TaKaRa Ex Taq HSが含まれていますので、激しい攪拌操作は避けてください。また凍結融解により反応性が低下する場合がありますので使用するチューブの試薬のみ融解してください。
キット以外に必要な試薬、機器
本キットを用いた検出過程では、さらに次のような試薬、機器を必要とする。
【試薬】
- 滅菌水
- アガロースゲル
PrimeGel Agarose PCR-Sieve（製品コード 5810A）
- 電気泳動用 buffer
Tris-Acetate-EDTA Buffer (TAE) 50x Powder, pH8.3（製品コード T9131）
またはTBE (Tris-borate-EDTA) powder（製品コード T905）
- DNAマーカー
100 bp DNA ladder（製品コード 3407A/B）
- Loading buffer（6× ： 36% glycerol, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol, 30 mM EDTA）（4. に記載のDNAマーカーには添付されている。）
- DNA染色剤
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain（製品コード 5760A/5761A）
またはエチジウムブロマイド
【機器】
- ヒートブロック（95℃まで温度を上げられるもの）
- 1.5 mlチューブ対応型冷却遠心機
- サーマルサイクラー
TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch（製品コード TP350）
TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient/Standard（製品コード TP600/TP650）
- 電気泳動装置
Mupid-2plus（製品コード M-2P）
Mupid-exU（製品コード EXU-1）
- 電気泳動ゲル撮影装置（SYBR Green Iを使用される場合は専用のフィルターが必要です。）
【その他】
- 1.5 mlチューブまたは0.2 ml PCR tube [ 0.2 ml Hi-Tube Dome Cap（製品コード NJ200）など ]
- 200 μl ＆ 20 μlマイクロピペット
- マイクロピペット用チップ
- アガロースゲル染色用トレイ（SYBR Green Iを使用される場合はポリプロピレン製容器を使用してください。）
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