SMARTer® Target RNA Capture for Illumina®

  • わずか10 ngのtotal RNAからtranscriptの濃縮と全長cDNA調製が可能
  • 1エクソンに対して1プローブ使用で高感度にターゲット特異的に濃縮
  • smallからmediumのターゲットサイズ(<100遺伝子)に対応
  • 融合遺伝子を含む微量transcriptの検出
RNA-Seq解析関連製品
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 635035 Z5035N SMARTer® Target RNA Capture for Illumina®
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
12回 ¥267,800
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 635036 Z5036N SMARTer® Target RNA Capture for Illumina®
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
48回 ¥803,400
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 635039 Z5039N Capture Beads
250 μl×4 ¥100,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

SMARTer Target RNA Capture for Illuminaは、Targeted RNA-Seq用のcDNAを調製するシステムである。Targeted RNA-Seqは、total RNAから目的のtranscriptを濃縮することにより、微量に存在するターゲット配列を高感度に検出でき、高いシーケンスカバー率を取得できる。更に、解析をシンプルにし、解析コストが削減できるという利点もある。
cDNA合成前に目的のtranscriptを濃縮にすることによって、キメラ融合遺伝子、アイソフォーム、スプライシングバリアントなど、全トランスクリプトーム解析では検出しにくく、検出に大量のリード数が必要となるtranscriptの情報を得ることが可能となる。検出感度の向上によって、微量のRNAからも信頼性の高い解析が可能になる。
SMARTer Target RNA Capture for Illuminaのワークフローには、ビオチン化DNAプローブ*1とtotal RNAを4時間以内にハイブリダイズするステップ、余剰プローブの除去精製、ストレプトアビジン磁性ビーズ(Capture Beads)によるターゲット配列の捕捉のステップが含まれている。Capture Beadsは、タンパク質、核酸低吸着性で逆転写反応、PCR反応を阻害しないため、ビーズ上でcDNA合成を行うことが可能である。
本製品は、高感度なSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencingの手法を利用しているため、濃縮したトランスクリプトから高品質なcDNA全長配列が作製できる。また、わずか10 ngのtotal RNA*2を出発材料とするようにデザインされており、100 pgのtotal RNAを用いた成功例もある(TECH NOTE参照)。分解の少ない高純度なtotal RNAを出発材料としてデザインされており、逆転写反応にはOligo dTプライマーを用いるためrRNA除去のステップや試薬は不要で、本製品にはイルミナ社シーケンサーのプラットフォームに適したcDNA調製に必要な試薬が全て含まれている。transcriptの濃縮に用いるCapture Beadsはキットに含まれている他、別売も用意されている。cDNA調製後は、イルミナ社のNextera XT DNA Sample Preparation Kitを用いてライブラリーを作製する。

*1 ターゲット特異的な60 merのビオチン標識プローブが必要
*2 total RNA 1 μgまで使用可能
SMART-Seq Target RNA Capture for Illuminaを用いたライブラリー作製の概要
図1.SMARTer Target RNA Capture for Illuminaを用いたライブラリー作製の概要
RNAサンプルからのrRNAの除去は不要で、ハンズオンタイムは実質2.5~3時間、2日間でライブラリー作製が完了する。


Bioanalyzerでの解析例
図2.Bioanalyzerでの解析例
パネルAは、ポジティブコントロールとしてキット添付のControl Total RNAとHPRT1Control ProbeをハイブリダイズさせてCapture Beadsで捕捉、SMART-Seq v4による逆転写後、20 CycleのPCR増幅を行った。その結果、1,400~1,650 bpの間にシングルピークが見られた。パネルB(no RNA)、パネルC(no probe)は、パネルAと同じ条件で実施したネガティブコントロールで、いずれもピークは見られなかった。パネルDはControl RNA 10 ngと10種類の異なる遺伝子に対するプローブをハイブリダイズさせ、17 CycleのPCR増幅を行って得られた結果で、cDNAのプロファイルを示している。

内容

  • SMARTer Target RNA Capture for Illumina(製品コード 635035, 635636)
     Package 1
      Control Total RNA (1 μg/μl)
     Package 2
    SMART-Seq v4 Oligonucleotide (48 μM)
    PCR Primer II A (12 μM)
    5X Ultra Low First-Strand Buffer
    SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
    3' SMART-Seq CDS Primer II A (12 μM)
    RNase Inhibitor (40 U/μl)
    Nuclease-Free Water
    10X Lysis Buffer
    Elution Buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.5)
    10X SSC
    DMSO (100%)
    GC-Melt
    1X Wash Buffer
    2X Capture Buffer
    HPRT1 Control Probes (1 pmol/μl)
     Package 3
    Capture Beads (1%)
    SeqAmp DNA Polymerase (製品コード 638504)
    SeqAmp DNA Polymerase
    SeqAmp PCR Buffer(2X)
  • Capture Beads(製品コード 635039)
     Package 1:
      Capture Beads (1%) 250 μl×4
     Package 2:
      2X Capture Buffer 480 μl×5
      1X Wash Buffer 30 ml×3

保存

Control Total RNA: -70℃.
Capture Beads:4℃(凍結不可)
その他のコンポーネント:-20℃
 (10X Lysis Buffer:融解後は4℃保存。Elution Buffer、10X SSC、1X Wash Buffer、DMSO:融解後は室温保存)

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

ターゲット特異的プローブ
ターゲット特異的な60 merのビオチン標識プローブ

PCR増幅およびバリデーション:
・Hybridization、およびFirst-Strand cDNA 合成専用のPCRサーマルサイクラー
・Double-Strand cDNA 増幅専用のPCRサーマルサイクラー
・High Sensitivity DNA Kit(Agilent社 Code 5067-4626)

SPRI Bead精製:
・Agencourt AMPure PCR Purification Kit(5 ml Beckman Coulter社 Code A63880 ; 60 ml Beckman Coulter社 Code A63881)

Capture Beads:
・Tube rotator(SilentShake Revolver社Code HYQ-1130A; Sections V.B and V.D、または同等品)

シーケンスライブラリー作製:
・Nextera XT DNA Sample Preparation Kit(Illumina社 Code FC-131-1024, FC-131-1096)

その他
・シングルチャンネルピペット: 10 μl、20 μlおよび200 μl
・12連チャンネルピペット: 20 μl、200 μl
・フィルターピペットチップ: 10 μl、20 μlおよび200 μl
・1.5 ml tube用minicentrifuge
・0.2 ml tubeまたはstrip用minicentrifuge
・Magnetic separation device 2個(1個はPCR前、1個はPCR後に使用)
Magnetic Separator - PCR Strip(製品コード 635011)、または96-well magnetic separation device (Thermo Fisher Scientific社 Code AM10027)
・Nuclease-free thin-wall PCR tube(0.2 ml;USA Scientific社 Code 1402-4700)、tube strip、または96well Plate(0.2-ml PCR 8-tube strip; USA Scientific社Code.1402-4700、または 96-well V-bottom Plate, 500 μl; VWR社 Code 47743-996を推奨)
・Nuclease-free low adhesion 1.5 ml tube(USA Scientific社 Code 1415-2600)

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