本製品はCRISPR/Cas9、TALENs、zinc finger nucleaseなどによるゲノム編集によって、ゲノムDNAに導入された挿入や欠失などの配列を確認するためのサンプルを調製するキットである。

キットには、ターゲット部位の増幅、クローニング、シーケンス用サンプルの調製に必要な試薬が全て含まれており、迅速で信頼性の高い結果を得ることができる。 PCR酵素は、細胞からのダイレクトPCRが可能なTerra PCR Direct Polymerase Mixを用いており、DNA抽出を行うことなく、細胞や細胞ライセートから直接ターゲットDNA配列を増幅することができる。
操作は、Terra PCR Direct Polymeraseを用いて細胞ライセートから直接ターゲット部位を含むDNAフラグメントの増幅を行い、次にIn-Fusion HD Cloning Kitを用いて制限酵素処理することなく増幅フラグメントを直接pre-linearized pUC19ベクターにクローニングする。添付のStellar Competent Cellsを用いた形質転換後、得られた複数のコロニーよりコロニーPCRを行い、ターゲット領域を増幅、精製し、シーケンス確認用サンプルを調製する。シーケンス解析により、ターゲットとなるゲノム部位への挿入欠損配列を確認することができる。

図1．実験ワークフロー

Step1	細胞ライセートから直接ターゲットサイトを含むゲノムDNA配列（500～700 bp）を増幅する。増幅産物には個々の細胞のゲノム編集部位がプールされる。（注：増幅にはIn-Fusionクローニング用に各15塩基を付加したプライマーを使用）
Step2	In-Fusion HD Cloning Kitを用いてpre-linearized pUC19ベクターにPCR産物を直接クローニングする。
Step3	形質転換後、コロニーPCRによりプラスミドのインサート部分を増幅する。
Step4	DNAシーケンス解析を行い、ターゲットゲノムサイト上に生じた個々の挿入、欠失の配列を確認する。

図2．CRISPR/Cas9によるゲノム編集後のCD81遺伝子の挿入、欠失配列の確認
Cas9をコードするプラスミドとCD81遺伝子をターゲットとしたsgRNAをHeLa細胞にトランスフェクションした。Guide-it Indel Identification Kitを用いてCD81ターゲット領域のシーケンス確認用サンプルを調製し、配列確認を行った。6クローンのシーケンスデータと元の配列とのアライメントを行って、CD81遺伝子上に導入された変異配列を確認した。

• Guide-it Indel Identification
  

  Terra PCR Direct Polymerase Mix	110 μl
  2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2＋, dNTP)	1 ml×3
  Extraction Buffer 1	400 μl
  Extraction Buffer 2	40 μl
  pUC19 Cloning Vector, linearized (50 ng/μl)	10 μl
  Colony PCR Forward Primer (15 μM)	200 μl
  Colony PCR Reverse Primer (15 μM)	200 μl
  PCR-Grade Water	1 ml×6

• In-Fusion HD Cloning Kit
• NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
• Stellar Competent Cells（製品コード 636763）

Guide-it Indel Identification	－20℃
In-Fusion HD Cloning Kit	－20℃
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	室温
Stellar Competent Cells 　　　Stellar Competent Cells ：－70℃ 　　　その他のコンポーネント：－20℃