フリューダイムC1システム用のcDNA調製キット

SMART-Seq® v4 Ultra® Low Input RNA Kit for the Fluidigm® C1™ System

  • Fluidigm社 C1システムで単離された単一細胞から直接cDNAを合成
  • 高品質のRNA-Seq(RNA Sequencing)解析データを取得可能
  • 2日間でライブラリー構築が可能
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メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書
データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN 635025 Z5025N SMART-Seq® v4 Ultra® Low Input RNA Kit for the Fluidigm® C1™ System, 4 IFCs
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
4 chips ¥265,000
説明書・データシート・ベクター情報
CLN 635026 Z5026N SMART-Seq® v4 Ultra® Low Input RNA Kit for the Fluidigm® C1™ System, 10 IFCs
  • 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法)
  • 安全データシート(SDS)添付
  • ライセンス
10 chips ¥530,000
説明書・データシート・ベクター情報

製品説明

本製品は、Fluidigm社 C1システム(IFC)で単離された細胞からSingle-Cell mRNA Sequencingに用いるcDNAを調製するためのキットである。逆転写酵素、PCR酵素などcDNA合成に必要な全ての試薬が含まれており、96-IFC formatでキャプチャーされた細胞からFluidigm C1 Single-Cell Auto Prep IFC for mRNA Seqなどを用いて質の高いcDNA合成を行うことができる。
本製品には、SMART-Seq v4の試薬が含まれており、従来のSMART(Switching Mechanism At 5’End of RNA Template)技術にLNA(Locked Nucleic Acid)技術を取り入れて進化させた最新のSMART技術を用いている。また、PCR酵素としてSeqAmp polymeraseを採用しており、GC含量、AT含量が高い領域も効率よく増幅できる。
本製品により、従来技術に比べて極めてバックグラウンドが低く、より多くの遺伝子配列同定と、高感度で再現性の高い優れたsingle-cell mRNA-seqライブラリーの作製が可能となる。
本製品は、4 IFC、10 IFC 2種類の反応スケールに対応しており、GC richな領域も効率よく増幅し、バラつきの少ない高い再現性を示す高品質のRNA-Seq(RNA Sequencing)解析データを取得可能である。 さらに、cDNA合成のハンズオン時間は約2時間、C1 SystemでのSMART-Seq v4反応は8時間で終了し、ライブラリー構築までは2日間で完了する。
ご注意:本製品の使用には、SMART-Seq v4 Scriptが必要です。Fluidigm社サイトより、ダウンロードしてください。
表1. 従来製品との比較

* 各ライブラリーから2Mリードをサンプリングして解析に用いた。
本製品(UL-v4)と従来品(UL-v1;SMARTer Ultra Low RNA Kit for the Fluidigm C1 System 製品コード 634832、634833)を用いて、K562細胞の単一細胞よりcDNAを合成した。各11個のcDNAからIllumina Nextera XT DNA Library Preparation Kitを用いてcDNAライブラリーを作製し、MiSeqでシーケンスした。
UL-v4の方がcDNAの収量が高く、Exonにマッピングされたリード数が多く、より多くの遺伝子が同定された。

図1. GC含量が異なる遺伝子の検出レベルの比較
本製品(UL-v4)と従来品(UL-v1;SMARTer Ultra Low RNA Kit for the Fluidigm C1 System 製品コード 634832、634833)を用いて、K562細胞の単一細胞よりcDNAライブラリーを作製した。発現遺伝子をGC含量に応じて3つのグループに分類し(Low:0~36%GC、Medium:37~62%GC、High:63~100%GC)、相関性を調べた。
UL-v4で作製したライブラリー同士(Panel A)、UL-v1で作製したライブラリー同士(Panel B)では、どちらも高い相関性が得られた。
UL-v4とUL-v1のライブラリーの比較(Panel C)では、GC含量が高い遺伝子(赤)はUL-v4で検出量が多く、GC含量が中程度(グレー)及び低い遺伝子(青)は同等に検出された。

図2. cDNAライブラリーの正確性
表1に示したcDNAライブラリーのアライメントを行って遺伝子のカウント数を調べ、結果を対数変換して遺伝子発現解析を行った。その結果、ピアソン相関係数は、UL-v4が優位に散布度が小さく高いピークを示した(Panel A)。hierarchicalクラスタリングを示したヒートマップでは、UL-v1に比べてUL-v4同士の方がユーグリッド距離が小さく、UL-v4は、より再現性が高くバラつきの少ない結果が得られることが示された。

内容

SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for the Fluidigm C1 System
SMART-Seq v4 Oligonucleotide (48 μM)
PCR Primer II A (12 μM)
5X Ultra Low First-Strand Buffer
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
3’SMART-Seq CDS Primer II A (12 μM)
RNase Inhibitor (40 U/μl)
10% Lysis Buffer
Nuclease-Free Water
SeqAmp DNA Polymerase(製品コード 638504、638509)
SeqAmp DNA Polymerase
SeqAmp PCR Buffer (2X)

保存

-20℃
(10% Lysis Buffer:融解後は4℃保存)

本製品以外に必要な試薬、機器(主なもの)

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。
機器、器具:
・C1 System(Fluidigm社 Code 100-7000)
・SMART-Seq v4 script(Fluidigm C1 Open App Script Hub(Fluidigm社サイト)よりダウンロード可能)
・画像解析装置(C1 IFCに適したもの)
・サーマルサイクラーおよびTube -ライブラリー増幅用
・Agilent 2100 Bioanalyzer
・Fluorometer –PicoGreen assay用
・シングルチャンネルピペット:10 μl、20 μlおよび200 μl
・8連チャンネルピペット:20 μl、200 μl
・12連チャンネルピペット:20 μl
・フィルターピペットチップ:2 μl、20 μlおよび200 μl
・1.5 ml tube用卓上遠心機
・0.2 ml tubeまたはstrip用卓上遠心機
・96ウェルプレート用遠心機
cDNA合成:
・C1 Single-Cell Auto Prep Reagent Kit(Fluidigm社 Code 100-6201)
・Fluidigm IFC(mRNA Seq、または Open App)
C1 Single-Cell Auto Prep IFC for mRNA Seq, 5–10 μm(Fluidigm社 Code 100-5759)
C1 Single-Cell Auto Prep IFC for mRNA Seq, 10–17 μm(Fluidigm社 Code 100-5760)
C1 Single-Cell Auto Prep IFC for mRNA Seq, 17–25 μm(Fluidigm社 Code 100-5761)
C1 Single-Cell Auto Prep IFC for Open App, 5–10 μm(Fluidigm社 Code 100-8133)
C1 Single-Cell Auto Prep IFC for Open App, 10–17 μm(Fluidigm社 Code 100-8134)
C1 Single-Cell Auto Prep IFC for Open App, 17–25 μm(Fluidigm社 Code 100-8135)
ライブラリー作製:
・C1 DNA Dilution Reagent(Fluidigm社 Code 100-5317)
・Nextera XT DNA Library Prep Kit(Illumina社 Code FC-131-1096)
・Nextera XT DNA Library Prep Index Kit(Illumina社 Code FC-131-1002、FC-131-2001、FC-131-2002、FC-131-2003、FC-131-2004)
・Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社 Code P11496)
・Agilent High Sensitivity DNA Kit(Agilent社 Code 5067-4626)
・Corning 384 Well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate(Corning社 Code 3573)
・96-well PCRプレート
・MicroAmp Clear Adhesive Film(Thermo Fisher Scientific社 Code 4306311)
SPRI Bead精製:
・Agencourt AMPure XP(5 ml:Beckman Coulter社 Code A63880、60 ml:Beckman Coulter社 Code A63881)
・100% Ethanol(molecular biology grade)
・Magnetic separation device 1.5 ml tube用
その他の推奨試薬:
・ArrayControl RNA Spikes(Thermo Fisher Scientific社 Code AM1780)-ポジティブコントロール
・THE RNA Storage Solution(Thermo Fisher Scientific社 Code AM7000)
・NucleoSpin RNA XS(製品コード 740902.10/50/250)

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