制限酵素の活性の定義、純度検定、保存、添付Bufferについて

活性の定義

制限酵素活性の1 Uは、各酵素反応液50 μl中、原則として37℃で1時間に1 μgのλDNAを完全に分解する酵素量とする。なお、活性測定に用いた基質および反応温度については、酵素ごとに記載している。他のUniversal Bufferでの相対活性は、「Universal Buffer・Basal Bufferによる制限酵素活性表示システム」に一括して記載している。

純度検定

各酵素Lotごとに下記の項目を基本にチェックしている。
1. Overdigestion Test
各精製酵素について、基質DNA(通常λDNA)1 μgと過剰量の酵素とを16時間反応させる。その後、アガロースゲル電気泳動のDNA泳動パターンによりnon-specific DNaseの有無を判定している。
2. Genome DNA Analysis
選定した制限酵素(酵素ごとに明記)についてチェックする。適当なBacterial Genome DNA(Agarose embedded、0.5μg DNA/50 μl Gel)に対して、20~150 Uの制限酵素を加え、16時間反応させる。その後パルスフィールド電気泳動を行い、DNA泳動パターンに乱れがないことを確認している。
概要については「Genome DNA Analysis Gradeについて」に一括して記載している。
3. Ligation-Recutting Test
基質DNAに対して、まず、2~50倍過剰の酵素を作用させる。切断されたDNAを回収し、5'末端濃度が0.1~1.0 μMになるようにT4 DNA Ligase Buffer[66 mM Tris-HCI(pH7.6)、6.6 mM MgCl2、10 mM DTT、0.4 mM ATP]に溶解させる。適当量のT4 DNA Ligaseを加え、16℃で1時間あるいは16~18時間反応させる。DNA回収後、制限酵素反応液に溶解させ、同じ制限酵素でDNAを再切断する。以上の結果により、ligase inhibitor、phosphatase、exonucleaseの有無を判定している。なお、Ligation効率、Recutting効率について、タカラバイオの品質規格を「Ligation-Recutting効率品質規格について」に一括して記載している。
4. Labeled oligonucleotide assay (LOA) test
LOA test は、酵素および試薬溶液のNuclease汚染の有無を確認するテストである。異なる蛍光を5'末端または3'末端に標識した2種類のOligo(配列中に制限酵素切断部位はない)を基質として、その基質に制限酵素を添加して1時間反応させる。その後、反応液を電気泳動し基質を検出する。もし制限酵素中にNuclease汚染があれば、反応後の基質は分解される。
蛍光検出した結果から基質の分解率を算出し、ごく微量の各種Nuclease(5'-exonuclease、3'-exonuclease、endonuclease)の有無を判定する。

保存温度・保存形状

各酵素とも-20℃で保存(ただし、Aat II については-80℃凍結保存)。
各酵素とも一回程度の凍結溶解であれば失活はみられない。保存形状については、「制限酵素形状一覧表」にその保存緩衝液および組成を一括して記載している。

添付Bufferについて

タカラバイオでは、各制限酵素に活性測定に用いた10×Bufferを添付している。また、全制限酵素に10×Loading Bufferを添付している。

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