定番のBCAタンパク質定量キット
- ビシンコニン酸（BCA）試薬を用いたタンパク質定量を行うための試薬セット
- 簡単な操作で短時間にタンパク質の定量が可能
- タンパク質の種類の違いによる変化が比較的少なく、0.02～2 mg/mlの広い範囲で直線性を示す
- 界面活性剤による影響を受けにくい
製品説明
TaKaRa BCA Protein Assay Kitは、高感度にタンパク質溶液の比色定量を行う試薬であり、界面活性剤によって可溶化されたタンパク質溶液の定量も可能である。
BCAによるタンパク質定量の原理は、2段階の反応に基づいている。第1段階では、タンパク質溶液中のペプチド結合によって、キットに含まれる二価銅イオン（Cu2＋）が一価銅イオン（Cu＋）に還元される。還元されるCu2＋の量は、溶液に含まれるタンパク質の量に比例する。第2段階では、2分子のbicinchoninic acid（BCA）がCu＋に配位して、562 nmに強い吸収を示す青紫色の錯体を形成する。これを分光光度計で測定して比色定量を行う。
BCAによるタンパク質定量は、タンパク質の種類の違いによる変化が比較的少なく、0.02～2 mg/mlの広い範囲で直線性を示し、界面活性剤による影響を受けにくいという特長を持っている。一方で、還元剤やキレート剤は反応を阻害するので、これらが含まれる溶液の定量には適さない。共存物質の影響については、表1を参照。
サンプルの定量は、キットに添付されるBSA標準タンパク質溶液の反応結果から検量線を作成して、サンプルと比較することで行う。
図1．0～2,000 μg/mlのBSA 標準曲線の例
BCAによるタンパク質定量の原理は、2段階の反応に基づいている。第1段階では、タンパク質溶液中のペプチド結合によって、キットに含まれる二価銅イオン（Cu2＋）が一価銅イオン（Cu＋）に還元される。還元されるCu2＋の量は、溶液に含まれるタンパク質の量に比例する。第2段階では、2分子のbicinchoninic acid（BCA）がCu＋に配位して、562 nmに強い吸収を示す青紫色の錯体を形成する。これを分光光度計で測定して比色定量を行う。
BCAによるタンパク質定量は、タンパク質の種類の違いによる変化が比較的少なく、0.02～2 mg/mlの広い範囲で直線性を示し、界面活性剤による影響を受けにくいという特長を持っている。一方で、還元剤やキレート剤は反応を阻害するので、これらが含まれる溶液の定量には適さない。共存物質の影響については、表1を参照。
サンプルの定量は、キットに添付されるBSA標準タンパク質溶液の反応結果から検量線を作成して、サンプルと比較することで行う。
内容
本製品は、標準的な1 ml反応系において500回、マイクロタイタープレートを用いた200 μl反応系において2,500回の測定を行うことができる。
1. BCA Reagent A 250 ml×2
2. BCA Reagent B 20 ml
3. BSA Standard Solution（2 mg/ml）＊ 1 ml×10
* BSA Standard Solutionは、安定剤として0.9％ NaCl、0.05％ NaN3を含む。
1. BCA Reagent A 250 ml×2
2. BCA Reagent B 20 ml
3. BSA Standard Solution（2 mg/ml）＊ 1 ml×10
* BSA Standard Solutionは、安定剤として0.9％ NaCl、0.05％ NaN3を含む。
保存
BCA Reagent A、BCA Reagent B：室温
BSA Standard Solution：4℃
＊ 本製品は4℃で出荷されます。受取後、BCA Reagent A、BCA Reagent B は室温で保存してください。
BSA Standard Solution：4℃
＊ 本製品は4℃で出荷されます。受取後、BCA Reagent A、BCA Reagent B は室温で保存してください。
キット以外に必要なもの
・1 mlのキュベット（1 ml反応系の場合）
・0.2 mlのマイクロキュベットまたはマイクロタイタープレート（200 μl反応系の場合）
・マイクロチューブ（2 mlまたは1.5 ml）
・インキュベーター（37℃）
・インキュベーター（60℃）（低濃度測定プロトコールの場合）
・分光光度計またはマイクロプレートリーダー
・0.2 mlのマイクロキュベットまたはマイクロタイタープレート（200 μl反応系の場合）
・マイクロチューブ（2 mlまたは1.5 ml）
・インキュベーター（37℃）
・インキュベーター（60℃）（低濃度測定プロトコールの場合）
・分光光度計またはマイクロプレートリーダー
共存物質の影響
BCA法は、界面活性剤や各種Buffer等の影響を比較的受けないという特長を持っているが、各種成分の濃度が高い場合は、測定に影響を受ける。本キットでの測定に影響がない濃度を表1に示す。
表1．標準プロトコールにおける各種試薬の許容濃度
表1．標準プロトコールにおける各種試薬の許容濃度
| 物質名 | 共存物質 許容濃度 |
|---|---|
| Salts / Buffers | |
| Ammonium sulfate | 0.15 M |
| Borate pH9.5 | 50 mM |
| Calcium chloride | 10 mM |
| Glycine | 100 mM |
| Guanidine-HCl | 4 M |
| HEPES, pH7.5 | 100 mM |
| Imidazole, pH7.0 | 50 mM |
| KPB, pH7.0 | 100 mM |
| Magnesium chloride | 10 mM |
| MES, pH6.1 | 100 mM |
| MOPS, pH7.2 | 100 mM |
| NaPB, pH7.0 | 100 mM |
| Nickel chloride | 10 mM |
| PIPES, pH6.8 | 100 mM |
| Sodium acetate, pH5.0 | 200 mM |
| Sodium azide | 0.20％ |
| Sodium chloride | 1 M |
| Sodium citrate, pH6.4 | 100 mM |
| Tricine, pH8.0 | 25 mM |
| Tris-HCl, pH8.0 | 50 mM |
| Zinc chloride | 10 mM |
| Detergents | |
| Brij-35 | 5％ |
| CHAPS | 5％ |
| NP-40 | 5％ |
| Triton X-100 | 5％ |
| Tween-20 | 5％ |
| SDS | 5％ |
| 物質名 | 共存物質 許容濃度 |
|---|---|
| Chelating agents | |
| EDTA | 10 mM |
| EGTA | 1 mM |
| Reducing agents | |
| Cysteine | 1 mM |
| Dithiothreitol | 1 mM |
| Glucose | 10 mM |
| 2-Mercaptoethanol | 0.01％ |
| Organic solvents | |
| Acetone | 10％ |
| DMSO | 10％ |
| Ethanol | 10％ |
| Methanol | 10％ |
| Misc. Reagents | |
| Glycerol | 50％ |
| Hydrochloric Acid | 100 mM |
| PMSF | 1 mM |
| Sodium Hydroxide | 100 mM |
| Urea | 3 M |
タンパク質の種類による影響
BCA法は、タンパク質の種類による測定値の変動が比較的少ないという特長がある。
図2は、一般的に標準物質として用いられるBSAおよびBGGの希釈系列を測定して作成した標準曲線である。表2には、代表的な15種類のタンパク質のBSAに対する発色率を示す。
図2．0～2,000 μg/ml濃度範囲におけるBSAとBGGの標準曲線
表2．標準プロトコールにおけるBSAに対する各種タンパク質の発色率
＊ Ratio＝（各種タンパク質の吸光度の平均値）／（BSAの吸光度の平均値）
図2は、一般的に標準物質として用いられるBSAおよびBGGの希釈系列を測定して作成した標準曲線である。表2には、代表的な15種類のタンパク質のBSAに対する発色率を示す。
表2．標準プロトコールにおけるBSAに対する各種タンパク質の発色率
| Protein | Ratio |
| Albumin, bovine serum（BSA） | 1.00 |
| Alcohol Dehydrogenase, Saccharomyces cerevisiae | 0.54 |
| Aldolase from rabbit muscle | 0.89 |
| Carbonic Anhydrase, bovine erythrocytes | 0.77 |
| a-Chymotrypsin, bovine pancreas | 1.06 |
| Cytochrome C, bovine heart | 0.90 |
| Gamma globulin, bovine（BGG） | 1.16 |
| Hemoglobin, bovine | 0.66 |
| IgG, rabbit | 1.29 |
| IgG, mouse | 1.15 |
| Insulin, human | 1.28 |
| Lysozyme, chicken egg white | 1.19 |
| Ovalbumin, chicken egg white | 0.95 |
| Transferrin | 0.85 |
| Trypsin | 0.98 |
関連資料
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