ゲノム編集された細胞集団における一塩基置換検出キット

Guide-it™ SNP Screening Kit

  • シーケンス不要のハイスループットSNPスクリーニング
  • 簡便、迅速な操作、4時間で終了
  • ゲノム全領域の塩基置換を検出可能
  • 倍数性にかかわらずゲノム編集を同定

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製品コード TaKaRa
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CLN 632652 Z2652N Guide-it™ SNP Screening Kit
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100回 ¥68,000
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CLN 632653 Z2653N Guide-it™ SNP Screening Kit
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400回 ¥195,000
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製品説明

Guide-it SNP Screening Kitは、CRISPR/Cas9システムを使用してゲノム編集された細胞集団において一塩基置換を検出できるキットである。本製品の使用により、ゲノム編集された96ウェルプレート中のクローンを迅速に同定できる。本製品は、ゲノム編集部位をPCR増幅後、構造特異的エンドヌクレアーゼを用いたアッセイにより迅速、簡便に蛍光検出するキットである。アッセイはクローンの倍数性やゲノム上の位置に関係なく行うことができる。
ゲノム編集の最も多い利用例として、特定ゲノム部位に一塩基多型(SNP)疾患と似た塩基置換を導入したり、終止コドンを導入し正確な遺伝子ノックアウトを行うことがあげられる。しかし、特に対応する表現形質がない場合は、一塩基置換を検出するために、数100クローンをスクリーニングする必要がある。Guide-it SNP Screening Kitの使用により、簡便、迅速に数100クローンのスクリーニングを行うことが可能となる。
実験ワークフロー
図1.実験ワークフロー

本図ではGからAへの塩基置換の検出例を示す。
ゲノム編集後、FACSか限界希釈法によりシングルセルクローニングを行い、増殖する。DNA抽出した後、ゲノム編集部位を含む領域をPCR増幅し、PCR産物(青部分)を2種類の相補オリゴDNA、displacement oligo(緑部分)とflap-probe oligo(紫部分)、とハイブリダイズする。flap-probe oligoにはフラップを形成する配列固定の非相補配列(薄紫部分)を付加している。この2種類のオリゴDNAがPCR産物とハイブリダイズすると、ゲノム編集結果によって2種類の構造を形成する。
ゲノム編集で変異が導入できたDNAでは、flap-probe oligoは変異部位で完全な塩基対を形成し、double-flap構造を生じる(フロー下)。Guide-it-Flapaseはdouble-flap構造を認識して切断する特異的ヌクレアーゼである。Guide-it-Flapase切断の結果で生じたフラップはGuide-it Flap Detectorにより認識され、蛍光シグナルを発する。
ゲノム編集で変異が導入されていないDNAでは、flap-probe oligoは変異サイトで完全な塩基対を形成せずギャップがあるため、Guide-it Flapaseによって切断されない(フロー上)。このようにGuide-it SNP Screening Kitで蛍光シグナルを検出することにより、塩基置換が起こっているかどうかを調べることができる。

SNPスクリーニング結果の比較
図2.SNPスクリーニング結果の比較

ホモ、ヘテロ、野生型の塩基置換を示す細胞を使用してSNPスクリーニングを行った。各ケースにおいて、ホモとヘテロサンプルで、十分に高い蛍光シグナルが得られた。

遺伝子型判定での使用
図3.遺伝子型判定での使用

コーリエル医学研究所から得られた、NCP1 またはCFTR遺伝子にSNPを有する細胞をGuide-it SNP Screening KitとサンガーシーケンスによりSNP解析した。パネルAでは、2種類のflap-probe oligoを作製し、A>G置換でのAとGを別々にアッセイし、ホモかヘテロかを決定した。パネルBでは、T>A置換において、野生型かホモかを解析した。全ての結果は、サンガーシーケンスの結果(図3下)と一致した。

各遺伝子座における塩基置換の検出
図4.各遺伝子座における塩基置換の検出

コーリエル医学研究所から得られたゲノムDNAを解析した。各ゲノムDNAは各遺伝子座で野生型かホモ接合型である。野生型(赤色)やネガティブコントロール(灰色)で得られた蛍光シグナルと比較して各塩基置換がホモ接合型のサンプル(青色)では、全ての置換において、明らかに強いシグナルを示した。

内容

• MightyPrep Reagent for DNA
• Guide-it SNP Positive Control Mix
• Guide-it SNP Negative Control Mix
• Terra PCR Direct Polymerase Mix
• 2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP)
• Dilution Buffer
• RNase-free Water
• Annealing Buffer
• Flapase Buffer
• Guide-it Flapase
• Guide-it Flap Detector (40X)

保存

MightyPrep Reagent for DNA:4℃
その他:-20℃

キット以外に必要な機器、試薬

• Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without Ca2+ & Mg2+ (Sigma-Aldrich, Cat.No. 8537)など
• ホットプレート
• サーマルサイクラー
• 96ウェルプレート
• 12連ピペット20 μl、200 μl用
• 96ウェルプレート用低速遠心機
• 低吸着チューブ (Eppendorf, Cat. No. 022431005など)
• プレートリーダー(励起485 nm、発光535 nm)
• 96ウェル(黒)プレート (Corning, Cat. No. 3631など)

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