正確性の高いsmall RNA-Seqを実現

SMARTer® microRNA-Seq Kit

  • 独自のライゲーション技術により正確性が高く、再現性の高いsmall RNA-Seqが可能
  • 100 ng~1 μgのtotal RNAまたは2~200 ngのsmall RNAからライブラリー作製
  • シングルチューブ操作のため、高品質なsmall RNAライブラリーを6時間で作製可能(サイズセレクション除く)
メーカー
略称
製品コード TaKaRa
Code
製品名 容量 価格(税別)
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データシート
ベクター情報
参考
資料
CLN R500653 RB5653 SMARTer® microRNA-Seq Kit
  • New
  • RNAシーケンス解析
  • ライセンス
16回 ¥165,000
¥132,000
2018/07/02~
2018/08/31

説明書・データシート・ベクター情報
CLN R500654 RB5654 SMARTer® microRNA-Seq Kit
  • New
  • RNAシーケンス解析
  • ライセンス
48回 ¥450,000
¥360,000
2018/07/02~
2018/08/31

説明書・データシート・ベクター情報
CLN R500655 RB5655 SMARTer® microRNA-Seq Kit
  • New
  • RNAシーケンス解析
  • ライセンス
96回 ¥815,000
¥652,000
2018/07/02~
2018/08/31

説明書・データシート・ベクター情報

※色文字での表示は、キャンペーン価格およびそのキャンペーン期間です。

製品説明

SMARTer microRNA-Seq Kitはtotal RNAまたはsmall RNAからイルミナ社次世代シーケンサー用のmicroRNA(miRNA)シーケンスライブラリーを高品質に作製するキットである。独自のMAGIC(Mono-Adapter liGation and Intramolecular Circularization)技術によりライゲーションによるバイアスを最小限に抑え、100 ng~1 μgのtotal RNAまたは2~200 ngのsmall RNA(miRNA含む)からライブラリーを作製できる。
MAGIC技術はsmall RNAやmiRNAを再現性良く、正確に、高感度に捉えることができるため、信頼性の高いシーケンス結果を得ることができる。さらにキットは、1チューブ内の一連操作により、6時間以内にライブラリー作製が完了する(サイズセレクションを除く)。
MAGIC技術を用いたSMARTer microRNA-Seq Kitのライブラリー作製概要
図1.MAGIC技術を用いたSMARTer microRNA-Seq Kitのライブラリー作製概要

まず最初に5'リン酸基、3'水酸基を含むmiRNA分子がアデニル化アダプターとライゲーションされる。但し、アダプターの3'末端はリン酸基によってブロックされている。ライゲーションされた分子はその後、脱リン化され、アダプターダイマーブロッキング反応を経て、すべての分子が環状化される。環状化されたmiRNA分子は逆転写反応され、その後サンプルインデックス配列を含むプライマーを用いてPCR増幅される。増幅産物は精製後、サイズセレクションを行い、イルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリーが完成する。



図2.microRNAライブラリーの正確性と高感度miRNA検出

SMARTer microRNA-Seq Kitと他社のライゲーションベースのライブラリー作製キットを比較した。963種類の合成microRNAを等モル混合したmiRNAプールサンプル10 ngから、SMARTer microRNA-Seq Kitまたは他社microRNAライブラリー作製キットを用いてライブラリー作製し、シーケンス解析をした。963種のmiRNAを含むリファレンス配列を用いてマッピング、リード数カウント、ノーマライズをして発現レベルを調べた。
パネルA:microRNA発現レベル(Y軸、logスケール)をmicroRNA種(X軸、発現レベルによってランク付けした)ごとにプロットした。予想発現レベル(=1)の上下の水平ラインは2倍のカットオフ値を示す。1 ngサンプルを使用した場合も同様の結果となった(データ示さず)。
SMARTer microRNA-Seq Kitによって検出された各々の合成microRNAの発現レベルは72%が2倍のカットオフ値以内で検出された。一方、他社キットの場合、13%~35%しか2倍のカットオフ値以内で検出されていないため、SMARTer microRNA-Seq Kitは他社キットより正確にmicroRNA発現レベルを検出できた。
パネルB:異なるリードカウント値(X軸, reads per million)において、検出されたmicroRNA(Y軸)数をプロットした。他社キットと比較して、SMARTer microRNA-Seq Kitはいずれのリードカウント値おいても、最も多くmicroRNAを検出した。


Sequencing metric RNA source
  Brain Placenta Spleen Universal human
reference RNA
smRNA (<200 nt, % of total RNA) 5 10~13 2 3
Input amount 1 μg 100 ng 1 μg 100 ng 1 μg 100 ng 1 μg 100 ng
Total number of reads 4,114,895 4,057,076 3,860,186 4,590,518 4,298,758 3,800,238 4,644,428 4,359,698
Reads trimmed (% of total reads) 77.91 83.07 61.18 57.38 69.62 66.6 89.09 84.29
Reads mapped to hg38 61.32 55.27 61.13 53.12 67.15 48.92 71.76 66.12
microRNA reads (% of total reads) 29.53 21.05 28.39 13.97 25.95 15.84 30.38 24.98
Number of microRNAs detected 676 497 520 515 442 410 708 603
piRNA, snoRNA, snRNA (% of total reads) 15.81 8.34 14.81 9.41 19.49 11.32 13.82 6.5
rRNA (% of total reads) 1.32 1.52 2.11 1.88 1.33 2.66 2.17 2.02
表1.各組織由来RNAからのシーケンス結果
microRNAの含有率が異なる4種のtotal RNA(100 ng or 1 μg)を用いてシーケンス解析を行った。参照配列hg38に対してマッピングしたところ、各Input量、RNA種において48~71%のマッピング率となった。また、miRNAのマッピング率はInput量、RNA種に関わらずほぼ同程度となった。さらに、miRNA以外のsmall RNA(piRNA、snoRNA、snRNA)も検出することができたが、rRNAに対するリードの割合は多くなかった。

内容

Package 1:
Adapter
Control microRNA (10 ng/μl)
Package 2:
Reaction Enhancer
Ligation Buffer
RNase Inhibitor (40 U/μl)
Ligation Enzyme Mix
Dephosphorylation Buffer
Dephosphorylation Enzyme Mix
Adapter Dimer Block
Circularization Buffer 1
Circularization Buffer 2
Circularization Enzyme Mix
RT Buffer (5X)
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
dNTP Mix (10 mM)
Amplification Buffer (2X)
Universal Primer (10 μM)
SeqAmp DNA Polymerase (1.25 U/μl)
Nuclease-Free Water
Package 3:
16回用(製品コード R500653)
Index Primer 1~8 (10 μM)

48回用(製品コード R500654)
Index Primer 1~24 (10 μM)

96回用(製品コード R500655)
Index Primer 1~24 (10 μM)
Package 4:
96回用(製品コード R500655)
Index Primer 25~48 (10 μM)

保存

Package 1(Adapter、Control microRNA):-70℃
その他のコンポーネント:-20℃

本製品以外に必要な試薬等

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。

ライブラリー調製
  • AMPure XP beads (Beckman Coulter社, Code A63881)
  • 100% エタノール
  • 1.5 ml チューブ用Magnetic stand
  • 8-tube strip用Magnetic stand(Magnetic Separator - PCR Strip、製品コード 635011)
  • 96-well plate用Magnetic stand (Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AM10027)

  • (オプション:96 well plate用 Magnetic stand使用時)
    96-well V-bottom Plate (500 μl; VWR社, Code 47743-996)
    MicroAmp Clean Adhesive Seal (Thermo Fisher Scientific社, Code 4306311)
    96-well plate用低速遠心機

サイズセレクション(ゲルからの抽出、または、Pippin Prep DNA Size Selection Systemを使用する)
ゲル抽出の場合:
  • Novex TBE Gels, 8%, 10 well (Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. EC6215BOX)
  • Novex Hi-Density TBE Sample Buffer (5X; Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. LC6678)
  • Novex Chamber for XCell SureLock Mini-Cells (Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. EI0013)
  • 10X TBE Buffer
  • 50 bp DNA Ladder または 10 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. 10416014、 10821015)
  • Nuclease-free water
  • SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. EI0013)
  • ゲル撮影装置
  • 1.5 ml マイクロチューブ
  • 7.5 M Ammonium acetate溶液
  • Corning Costar Spin-X Centrifuge Tube Filters (Sigma, Cat. No. CLS8162-96EA)
  • UltraPure Glycogen (Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. 10814010)

Pippin Prep キット使用の場合:
  • Pippin Prep DNA Size Selection System (Sage Science社, Code PIP0001)
  • Pippin Prep 3% Agarose Gel, dye-free, w/internal standards (100-200 bp) (Sage Science社, Code CDP3010)

その他
  • シングルチャンネルピペット: 10 μl、20 μl、200 μl
  • 8連チャンネルピペット: 20 μl、200 μl
  • フィルターピペットチップ: 2 μl、20 μl、200 μl
  • 1.5 ml tube用 微量遠心機
  • 0.2 ml tubeまたはstrip用 微量遠心機
  • 96 well plate用遠心機

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注意事項
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