PrimeDirect^® Probe RT-qPCR Mix

PrimeDirect Probe RT-qPCR Mixは、プローブ検出（5'-ヌクレアーゼ法）による1ステップリアルタイムRT-PCRの試薬である。本製品は2×プレミックスとなっており、ターゲット検出のためのプライマー・プローブと鋳型サンプルを添加するだけで反応が行える。本製品はリアルタイムPCR反応液中で生体試料から核酸をダイレクトに熱抽出できるため、RNAウイルス等を含む生体試料を核酸精製無しに直接反応液へ加え、リアルタイムPCR反応を行うことができる。反応液中で、核酸抽出、逆転写反応、qPCRを連続的に行えるため、操作性および反応時間が大幅に軽減される。
検査目的等で特定ターゲットを繰り返し検出する実験系においては、以前のPCR産物の持ち込み（キャリーオーバーコンタミネーション）が問題となるが、Uracil N-Glycosylase（UNG）が含まれた製品（PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG）を使用することでdUTPを含むPCR産物を分解することができる。本製品を継続して使用することで、キャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性反応を回避できる。^＊
本製品は、ヘパリン（血液）やフミン酸（土壌）といった様々なPCR阻害物質に対して最高レベルの耐性を示すため、様々な生体試料からダイレクトにウイルスや細菌の検出、あるいは遺伝子の発現解析といったアプリケーションに使用可能である。
＊ PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG使用の場合

なお、本製品は以下のリアルタイムPCR装置で使用できることを確認している。
・Thermal Cycler Dice Real Time System III（製品コード TP950/TP970/TP980/TP990）
・CronoSTAR 96 Real-Time PCR System（製品コード 640231/640232）
・CronoSTAR Portable Real-Time PCR System（製品コード 640245/640247/640249）
・Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）
・Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）
・LightCycler 96 System（Roche Diagnostics社）
・CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad社）など

RR650A（200 回；25 μl反応系）

PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix（2×）	625 μl×4
（RR651Aの場合　PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG（2×）	625 μl×4）
RNase Free Water	1.25 ml×2
ROX Reference Dye（50×conc.）＊	100 μl
ROX Reference Dye II（50×conc.）＊	100 μl

＊ Applied BiosystemsのリアルタイムPCR装置など、ウェル間の蛍光シグナル補正を行う装置を使用する場合に添加します。

• ROX Reference Dye を添加する機種
  StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）
• ROX Reference Dye II を添加する機種
  Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）
• 添加の必要がない機種
  Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズ（製品コード TP950など）
  CronoSTAR 96 Real-Time PCR System（製品コード 640231/640232）
  CronoSTAR Portable Real-Time PCR System（製品コード 640245/640247/640249）
  LightCyclerシリーズ（Roche Diagnostics社）
  CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad社）

－20℃

1. プローブ検出用ワンステップRT-qPCR試薬
2. 反応液中にて生体試料から核酸をダイレクトに熱抽出
3. 高温での逆転写反応（55～65℃）
4. 様々な阻害物質に対する最高レベルの阻害耐性
5. UNGの作用により、キャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を回避（製品コード RR651A/Bのみ）

ヘパリン血およびその10倍希釈液に黄色ブドウ球菌（S. aureus）培養希釈液を5段階濃度でスパイクしたサンプル 1 μlを反応に用いて、16S rRNA遺伝子の検出を行った。ヘパリン血 1 μlあたり、約100 cfuの黄色ブドウ球菌を検出することができた。　N.D.：検出せず

尿原液に不活化ジカウイルスを2×10^-2～10³ copies/μlの濃度でスパイクしたサンプルを調製し、各1 μlを使用して、リアルタイムPCRによりジカウイルスの検出を行った。PrimeDirect Mixは尿による阻害の影響をほぼ受けることなく、尿中のジカウイルス2コピー以上を検出できた。
感染者の尿中の本ウイルスRNA濃度が2.1×10 copies/μlであったという報告もあることから（下記）、本試薬を用いた検査は充分な感度を満たす可能性が示唆された。
＊ Zikaウイルス感染者の尿中ウイルスRNA濃度の事例： 2.1×10 copies/μl
(https://www.niid.go.jp/niid/ja/id/2358-disease-based/sa/zika-fever/7169-zikara-11-170331.html)

様々な阻害物質存在下での反応性

試料：	Human HeLa total RNA 1 ng
ターゲット：	Human ACTB
結果：	PrimeDirectおよび各社ワンステップリアルタイムRT-PCR試薬の標準プロトコルを用いて、様々な阻害物質を添加し反応を試みたところ、PrimeDirectは各種の阻害物質に対して最高レベルの抵抗性を持つことが示された。