Thermal Cycler Dice® Real Time System シリーズを用いる場合の操作方法
TB Green Premix DimerEraser（Perfect Real Time）（製品コード RR091A/B）
- 下記に示すPCR反応液を調製する。
＜1反応あたり＞ 試薬 使用量 最終濃度 TB Green Premix DimerEraser（2×） 12.5 μl 1× PCR Forward Primer（10 μM） 0.75 μl 0.3 μM*1 PCR Reverse Primer（10 μM） 0.75 μl 0.3 μM*1 template（<100 ng） 2 μl *2 滅菌精製水 9 μl Total 25 μl*3 *1 最終primer濃度は0.3 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.2～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
*2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA（RT反応液）をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10％以下になるようにする。
*3 反応液量は25 μlを推奨。
- 反応を開始する。
PCRは、下記の3 step PCRによる標準プロトコールで行うことをお勧めします。
Thermal Cycler Dice Real Time System IIIの場合はNomal Mode（デフォルト設定）、Thermal Cycler Dice Real Time System IIおよびLite（終売）の場合はFast Mode（デフォルト設定）で行ってください。
反応性に問題がある場合には、下記の「PCR反応条件について」を参考に最適なPCR条件を検討してください。
3 step PCR 標準プロトコール
Speed：Fast
Hold（初期変性）
Cycle：1
95℃ 30秒
3 Step PCR
Cycle：40
95℃ 5秒
55℃ 30秒
72℃ 30秒
Dissociation -
反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
解析方法は、各装置の取扱説明書を参照してください。
※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃（5～）15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。
PCR反応条件について
初期変性
初期変性は通常95℃、30秒で充分です。環状プラスミドやゲノムDNAなど変性しにくい鋳型でも、ほとんどの場合、この条件で良好に反応できます。鋳型の状態によっては、95℃、1～2分程度に延長することが可能ですが、時間が長すぎると酵素の失活を招く恐れがありますので、2分以上の条件は推奨しません。
PCR 条件と反応特異性
反応特異性を上げるには、アニーリング温度を上げるか2 step PCRに変更します。特に高分子側の非特異的増幅が見られる（融解曲線分析で目的のターゲットより高いTm値のピークが見られる）場合には、2 step PCRへの変更が有効です。
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PCR条件と増幅効率
増幅効率を上げるには、伸長反応時間を延ばします。
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