Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time)

1. 以下に示すPCR反応液を調製する。
   ＜1反応あたり＞

   試薬	使用量	最終濃度
   Premix Ex Taq (2×)	12.5 μl	1×
   PCR Forward Primer (10 μM)	0.5 μl	0.2 μM*1
   PCR Reverse Primer (10 μM)	0.5 μl	0.2 μM*1
   プローブ	1 μl	*2
   ROX Reference Dye II*3	0.5 μl	1×
   template	2 μl	*4
   滅菌精製水	8.0 μl
   Total	25 μl

   *1	最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
   *2	プローブ濃度は、使用するリアルタイムPCR装置の機種やプローブの蛍光標識物質により異なる。装置の取扱い説明書やプローブ添付のデータシートを参考に添加量を検討する。
   *3	ウェル間の補正には、ROX Reference Dye II (50×) を使用する。ROX Reference Dye (50×) は濃度を高く設定しているため、Mx3000Pでの使用には適さない。
   *4	template中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA溶液（逆転写反応液）をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10％以下になるようにする。

2. 反応を開始する。
   PCRは、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まず、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください（下記の「PCR反応条件について」を参照）。
   
   

   シャトルPCR標準プロトコール 　　Segment 1：初期変性 　　　　95℃　　30秒 　　　　1サイクル 　　Segment 2：PCR反応 　　　　95℃　　 5秒 　　　　60℃　　20秒 　　　　40サイクル

3. 反応終了後、解析を行う。
   反応終了後、増幅曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。^*
   * 解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。

PCR反応条件について

初期変性

シャトルPCR

サイクル数：30～45サイクル