O-157 (ベロ毒素1型、2型遺伝子) PCR Typing Set Plus

【アルカリ熱抽出法】

食品培養液100 μlを1.5 mlまたは2.0 ml容量のねじ口チューブに採取する。
	← 10,000×g、4℃で10分間遠心して上清を除く 　← 沈渣にNaOH Solution（滅菌済み）100 μlを添加し、100℃で10分間加熱処理する
処理液50 μlを別チューブに採取する
	← 1 M Tris-HCl（pH7.0）（滅菌済み）8 μlを加えて中和する 　← 10,000×gで10分間遠心する
上清を検体とする

＊食品培養液は、それぞれ適切な標準プロトコールに従って食品サンプルから調製したものを用いる。また、熱抽出サンプルは－20℃で保存可能である。

1. PCRチューブ に以下の反応液を氷上にて調製する。
   ＜VT1の検出＞
   

   反応液組成	液量	終濃度
   10×Ex Taq Buffer	5 μl	［1×］
   dNTP Mixture（各2.5 mM）	4 μl	各200 μM
   EVT-1 primer	0.5 μl	0.19 μM
   EVT-2 primer	0.5 μl	0.19 μM
   菌体熱抽出サンプル	5～25 μl
   TaKaRa Ex Taq	0.25 μl	1.25 U/50 μl
   滅菌水	x μl
   Total	50 μl

   
   ＜VT2の検出＞
   

   反応液組成	液量	終濃度
   10×Ex Taq Buffer	5 μl	［1×］
   dNTP Mixture（各2.5 mM）	4 μl	各200 μM
   EVS-1 primer	0.5 μl	0.19 μM
   EVS-2 primer	0.5 μl	0.19 μM
   菌体熱抽出サンプル	5～25 μl
   TaKaRa Ex Taq	0.25 μl	1.25 U/50 μl
   滅菌水	x μl
   Total	50 μl

   Negative Controlとしてサンプルのかわりに滅菌蒸留水を添加したものをそれぞれ用意する。
   （1回のPCR反応に1本でよい）



2. PCRチューブに以下のコントロール反応液を氷上にて調製する。（1回のPCRにつき1本でよい）
   ＜VT1用コントロール＞
   

   反応液組成	液量	終濃度
   10×Ex Taq Buffer	5 μl	［1 × ］
   dNTP Mixture（各2.5 mM）	4 μl	各200 μM
   EVT-1 primer	0.5 μl	0.19 μM
   EVT-2 primer	0.5 μl	0.19 μM
   Control template EC2	0.5 μl	50 pg/50 μl
   TaKaRa Ex Taq	0.25 μl	1.25 U/50 μl
   滅菌水	39.25 μl
   Total	50 μl

   
   ＜VT2用コントロール＞
   

   反応液組成	液量	終濃度
   10×Ex Taq Buffer	5 μl	［1×］
   dNTP Mixture（各2.5 mM）	4 μl	各200 μM
   EVS-1 primer	0.5 μl	0.19 μM
   EVS-2 primer	0.5 μl	0.19 μM
   Control Template EC3	0.5 μl	50 pg/50 μl
   TaKaRa Ex Taq	0.25 μl	1.25 U/50 μl
   滅菌水	39.25 μl
   Total	50 μl



3. 必要であればサンプルの蒸発を防ぐために、ミネラルオイル（製品コード O186-2302）50 μlで反応液を覆う。（TaKaRa Thermal Cycler Diceを使用する場合は必要ない）



4. PCRチューブをサーマルサイクラーにセットし、PCR反応を開始する。

   PCR条件

   94℃	1 min		35 cycles
   55℃	1 min
   72℃	1 min
   72℃	10 min		1 cycle

   反応は約2.5時間で終了する。反応後のサンプルは4℃、または－20℃で保存可能である。



5. 反応終了後、反応液10 μlをアガロースゲル電気泳動する。
   （アガロースゲルは3％ PrimeGel Agarose PCR-Sieveが望ましい）

サンプル中にベロ毒素1型遺伝子が存在すれば349 bpの増幅産物（バンド）が検出され、2型遺伝子および2型の変異型遺伝子が存在すれば112 bpの増幅産物が検出される。
また、Positive controlでは、VT1検出系でControl Template EC2を鋳型としたとき、686 bpの増幅産物が検出される。
VT2検出系でControl Template EC3を鋳型としたとき、705 bpの増幅産物が検出される。

電気泳動結果	判　　定
1）EVT-1/2 primerを使用した場合、サンプルのレーンに349 bpのバンドが認められる。	ベロ毒素1型遺伝子（VT1）陽性株である。
2）EVS-1/2 primerを使用した場合、サンプルのレーンに112 bpのバンドが認められる。	ベロ毒素2型遺伝子（VT2）または2型の変異型遺伝子（VT2vha、VT2vhb、VT2vp1、VT2vp2）陽性株である。
3）サンプルのレーンに349 bpまたは112 bpのバンドが認められず、かつPositive Controlのレーンにバンド（VT1検出系では686 bp、VT2検出系では705 bp）が検出された。	ベロ毒素遺伝子陰性株である。
4）サンプル、Positive Controlいずれのレーンにもバンドが検出されない。	陽性、陰性を確定できない。何らかの原因でPCR反応が正常に行われていない可能性が高いので、再度PCRを行う。
5）Negative Controlのレーンに349 bpもしくは112 bpのバンドが認められた。	コンタミネーションを起こしていると考えられる。 反応液調製場所、および使用した機器、試薬等を除染したうえで再度検出を行う。