Protocol
One Step TB Green™ High Speed RT-PCR Kit (Hyper-PCR™)（製品コード RR076A）
- 下記に示す反応液を氷上で調製する。
＜1反応あたり＞ 試薬 使用量 5×One Step High Speed Buffer 5 μl dNTP Mixture (10 mM each) 0.5 μl Forward primer (20 μM) 0.5 μl Reverse primer (20 μM) 0.5 μl PrimeScript II RT Enzyme Mix 0.5 μl High Speed PCR Enzyme 1.5 μl TB Green希釈液（用時調製）*1 1 μl template*2 1 μl RNase Free dH2O 14.5 μl total 25 μl *1 TB Green Solution (×250)をRNase Free dH2Oで10倍希釈する。
例：TB Green Solution (×250) 2 μl＋RNase Free dH2O 18 μl*2 total RNAは20 pg～20 ngをtempleteとして使用することが望ましい。
- 反応を開始する。
反応液を軽く遠心後、お手持ちのリアルタイムPCR装置にセットし、反応を開始する。
Stage1：逆転写反応 45℃、1分 95℃、1分 Stage2：3 Step PCR 98℃、 X秒*3 40～50サイクル 55℃*4、 Y秒*3 68℃、 Z秒*3 Stage3：融解曲線分析 あるいは Stage2：2 Step PCR 98℃、 X秒*3 40～50サイクル 60℃*4、 Y秒*3
*3 お手持ちのリアルタイムPCR装置の最速条件でお試しください。 *4 まずこの温度で試し、必要があれば至適化してください。 - 反応終了後、解析を行う。
反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。* 解析方法は、お手持ちのリアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。
