AAVpro^® Helper Free System (AAV-2xU6) / (AAV-U6-ZsGreen1)

本キットではヘアピン型RNAを発現させるための合成オリゴDNAのクローニングに、In-Fusion HD Cloning Kit（製品コード 639648など）の使用を推奨する。
ヘアピン型RNAを発現させるためには、［末端相同配列（15塩基）－標的配列（センス）－ループ配列－標的配列（アンチセンス）－ターミネーター配列－末端相同配列（15塩基）］の順でデザインした二本鎖合成DNAを用意し、In-Fusion反応でプロモーターの下流に挿入する。
挿入配列として、下図に示すような合成オリゴDNAを作製する（Top strand とBottom strand の2本；N部分が標的配列）。pol III系プロモーターの転写開始点はプリン塩基（GまたはA）が好ましいため、標的配列がGまたはAで始まらない場合は標的配列の前にGまたはAを挿入する。
Xba I-Spe IサイトにはshRNA oligo DNA-1を、Sal I-Xho IサイトにはshRNA oligo DNA-2を挿入する。

ここではループ配列の例としてCTGTGAAGCCACAGATGGG（Boden et al.^1））を挙げているが、GTGTGCTGTCC（Miyagishi et al. ^2））も有用であることが確認されている。これ以外のヘアピンループとして、Lee et al. ^3）、Paddison et al. ^4）、Paul et al. ^5）、Sui et al. ^6）らによってそれぞれ異なった配列が報告されている。
1つのベクターに2つのshRNA発現ユニットを搭載する場合には、ベクター内での組換えのリスクを軽減する目的で2つのshRNAに別々のループを使用することを推奨する。
ターミネーター配列にはTTTTTT配列を用いる（Tが4つ続くとpol III系プロモーターによる転写が止まる）。siRNA配列と用いるヘアピンループ配列の組み合わせによってはTが4つ以上続く可能性があるため、合成DNAをデザインした後には必ず、Top strandにTが4つ以上続いていないことを確認することが必要である。

注：クローニングの手順については説明書をご確認ください。

In-Fusion反応用 合成DNA配列

shRNA oligo DNA-1（Xba I-Spe Iサイト）
＜末端相同配列―標的配列（センス）－ループ配列－標的配列（アンチセンス）－ターミネーター配列―末端相同配列＞

shRNA oligo DNA-2（Sal I-Xho Iサイト）
＜末端相同配列―標的配列（センス）－ループ配列－標的配列（アンチセンス）－ターミネーター配列―末端相同配列＞

＊ターゲット配列の最初の塩基がGまたはAでない場合はターゲット配列の前にGまたはAを挿入すること。

[シーケンス用プライマー]
shRNA oligo DNA-1配列確認用プライマー5’-AAGCTTGAATTCGATCCGACG-3’
shRNA oligo DNA-2配列確認用プライマー5’-GAATTCAAGCTTAAGGTCGGG-3’

注：	ベクター上のStuffer sequenceを挟む制限酵素サイトを利用して、ライゲーションにより合成オリゴDNAをクローニングすることも可能です。 その場合の合成オリゴDNAのデザイン等は、取扱説明書を参照してください。