pBAsiベクターシリーズ

実験例-2 siRNA発現アデノウイルスによるノックダウン

実験例-1でRNAi効果を確認したpBAsi-hU6-GFPから、「プロモーター+ヘアピン型RNA配列」をEcoR Vで切り出してアデノウイルス作製用コスミドpAxcwitのSmi I(Swa I)部位に挿入した。アデノウイルスの作製はAdenovirus Expression Vector Kit(Dual Version)のプロトコールに従って行い、6.0×109 pfu/mlのウイルス液を得た。得られたsiRNA発現アデノウイルスをGFP発現細胞に感染し、蛍光強度の変化を観察した(下図)。siRNA発現アデノウイルスによるRNAi効果が確認できた。

あらかじめHepG2(ヒト肝臓由来)にGFPを導入した細胞を構築しておき、この細胞に組換えアデノウイルスをMOI=60で感染し、5日後にフローサイトメーターで蛍光強度を観察した。

黒:HepG2
緑:GFP発現HepG2
赤:siGFP発現アデノウイルスを感染させたGFP発現HepG2
黄緑:siスクランブル(NC)発現アデノウイルスを感染させたGFP発現HepG2

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