【方法】
pUC118DNA 10 pgを鋳型に、
「プライマー設計について」で例示した各変異導入(置換、欠失、挿入)用プライマーとPrimeSTAR Maxを用いてPCR(50 μl)を行った。その2 μlを
E. coli JM109コンピテントセル(3×10
8 cfu/μg pUC118)100 μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後SOC培地1 mlを加えて37℃で1時間振とう培養した。そのうち100 μlを選択プレート(LB+Amp、IPTG、X-gal)上で培養し、白コロニー(変異体)と青コロニー(バックグラウンド)をカウントした。
【結果】
表 変異導入効率
変異のタイプ |
白コロニー |
青コロニー |
変異導入効率 |
置換(3塩基) |
1,948 |
6 |
99.69% |
欠失(3塩基) |
2,024 |
1 |
99.95% |
挿入(6塩基) |
1,280 |
2 |
99.84% |
※ 6塩基挿入に用いたプライマーは、キットコンポーネントのControl primer FとControl primer Rに相当する。
表に示すようにpUC118 DNA 10 pgを鋳型にした場合、3種類の変異導入体(置換、欠失、挿入)が99%以上の非常に高い確率で取得できることを確認した。