RspRS II(Mse I)

実験例: RspRS IIを用いたメチル化DNA濃縮のための前処理操作(Mse Iとの比較)

RspRS II(製品コード 1247A)

制限酵素RspRS IIはMse Iのアイソシゾマーであるが、至適反応温度が60℃と高く、Mse Iに比べて非常に安定な酵素である。
RspRS IIおよびMse Iの認識配列はTTAAであり、ゲノムDNA中で比較的GC-richなCpG Island周辺は切断しない。そのため、MCIp(Methyl-CpG Immunoprecipitation)などでメチル化CpG濃縮を行う際に、ゲノムDNAを断片化するために用いられる。
本実験では、Methyl-CpG binding domain protein2(MBD2)と磁気ビーズを利用してメチル化CpGを濃縮するEpiXplore Methylated DNA Enrichment Kitを用いて、RspRS IIにより断片化されたゲノムDNAが、Mse Iにより断片化されたゲノムDNAと同様に濃縮されることを確認した。

【実験の概要】
HeLa cell genomic DNA  4 μg
 ↓
RspRS II、またはMse Iによる断片化
 ↓
NuceloSpin Gel and PCR Clean-upを用いて反応液をクリーンアップ
 ↓
溶出液 60 μl → Fraction 0
 ↓
約1.2 μg分をEpiXplore Methylated DNA Enrichment KitでのCpGメチル化DNA濃縮に使用
  • Non-methylated and hypomethylated DNA → Fraction I
  • Methylated DNA → Fraction III

1)制限酵素反応(HeLa細胞由来ゲノムDNAの断片化)

RspRS IIおよびMse Iを用いて、HeLa細胞のゲノムDNAを断片化した。それぞれの推奨バッファーを用いた200 μl反応系で、ゲノムDNA 4 μgに対して各制限酵素100 Uを使用し、RspRS IIは60℃で、Mse Iは37℃で3時間反応を行った。

M1λ-Hind III digest
1HeLa cell genomic DNA
2RspRS II digest
3Mse I digesrt
1% Agarose L03使用
Fraction 0の2 μl分を泳動

2)反応液のクリーンアップ

NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(製品コード 740609.10)を用いて、上記反応液をクリーンアップし、
60 μlで溶出した。⇒[Fraction 0]。それぞれNanodropでOD260を測定し、DNA濃度を求めた。

DNA濃度
Fraction 0 of RspRS II digest62.9 ng/μl
Fraction 0 of Mse I digest65.7 ng/μl
M1λ-Hind III digest
1HeLa cell genomic DNA
2Fraction 0 of RspRS II digest
3Fraction 0 of Mse I digesrt
M2DL2,000 DNA Marker
1% Agarose L03使用
Fraction 0の2 μl分を泳動

3)CpGメチル化DNAの濃縮

各Fraction 0の約1.2 μg分を、EpiXplore Methylated DNA Enrixchment Kit(製品コード 631963)を用いたCpGメチル化DNA濃縮に使用した。プロトコールに従って、MBD2への結合・洗浄・溶出を行い、各画分をエタノール沈殿で回収して30 μlに溶解した。

・NanodropによるDNA濃度測定~回収率の比較
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画分
(ng/ul)
DNA濃度
(ng)
回収量
(ng)
開始量
(ng)
回収率
(%)
備考
RspRS II - Fraction I
34.32
1029.6
1200
86
Non-methylated
RspRS II - Fraction III
2.72
81.6
7
Methylated
Mse I - Fraction I
30.15
904.5
1200
75
Non-methylated
Mse I - Fraction III
4.5
135
11
Methylated
Control - Fraction I
5.47
164.1
400
41
Non-methylated
Control - Fraction III
5.73
171.9
43
Methylated
Control(EpiXplore Methylated DNA Enrixchment Kit のコンポーネント):Methylated DNA 200 ng+Non-methylated DNA 200 ng

4)PCR増幅による比較

RspRS II digestおよびMse I digestから得たFraction 0、I、IIIをそれぞれ鋳型として、非メチル化状態が予想されるexon領域、あるいはメチル化が予想されるCpG Islandを含むプロモーター領域やその周辺をターゲットとしてPCR増幅を行った(Negative Control-1、2、およびPositive Control-1~3)。増幅にはTks Gflex DNA Polymerase(製品コード R060A)を使用した。

【ターゲット】
泳動レーン ターゲット 増幅サイズ(bp)
1 NC-1:HBB(exon) 237
2 NC-3:HBB2(exon') 216
3 PC-1:CD14(CpG) 460
4 PC-2:HOXA2(CpG) 300
5 PC-3:GULT4(CpG) 200
【反応液】
鋳型DNA(30 ng/μl、または5 ng/μl) 1 μl
Tks Gflex DNA Polymerase 1 μl
2×Gflex PCR Buffer(Mg2+,dNTP plus)   25 μl
F-Primer(10 μM) 1 μl
R-Primer(10 μM) 1 μl
dH2O 21 μl
total 50 μl
【PCR反応液】
95℃ 5 min.
98℃ 10 sec.
30 cycles
60℃ 15 sec.
68℃ 30 sec.
4℃ Hold

・Fraction 0(Enzyme digested DNA)
鋳型量 30 ng

ターゲット
増幅予想
増幅結果
RspRS II
Mse I
NC-1
NC-3
+ 
+ 
+ 
PC-1
+ 
+ 
+ 
PC-2
+ 
+ 
+ 
PC-3
+ 
+ 
+ 
・Fraction I(Non-methylated DNA)
鋳型量 30 ng

ターゲット 
増幅予想 
増幅結果 
RspRS II
Mse I
NC-1
+ 
+ 
+ 
NC-3
+ 
+ 
+ 
PC-1
- 
+ 
+ 
PC-2
- 
+ 
+ 
PC-3
- 
+ 
+ 
・Fraction III(Methylated DNA)
鋳型量 5 ng

ターゲット 
増幅予想 
増幅結果 
RspRS II
Mse I
NC-1
- 
- 
- 
NC-3
- 
- 
- 
PC-1
+ 
+ 
+ 
PC-2
+ 
+ 
+ 
PC-3
+ 
- 
- 
Fraction I(Non-methylated DNA)でメチル化が予想される遺伝子(PC-1, 2, 3)の増幅が見られた*1、Fraction III(Methylated DNA)でPC-3の増幅が起こらなかったなど予想とは異なる結果もあったが、いずれもRspRS II digestとMse I digestで同じ結果が得られており、制限酵素RspRS II はMse Iと同様、メチル化CpG濃縮のためのゲノム断片化に利用できると考えられる。
*1 MBD2に結合せずに残存したMethylated DNAによる増幅と考えられる。

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