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免疫組織化学染色トラブルシューティング

Q1 染色が認められない、あるいは弱い。
A1 以下の対策が考えられます。
原因 対策
脱パラフィンが不完全・試薬の温度を室温に戻しておく。浸漬する時間を延長する。
・操作を行う前にスライドを10分程40~50℃に温めてパラフィンが溶解し易くしておく。
・定期的に試薬を新しいものと交換する。
検体スライドの乾燥・脱パラフィン後は組織が乾燥しないよう十分に気を付ける。
・湿潤箱などを利用して湿度コントロールされた状態で反応を行う。
・反応時間が長い場合は、カバースリップなどで組織を覆う。
アジ化ナトリウムの混在・緩衝液中にアジ化ナトリウムが含まれていないか確認し、微量であっても含まれている場合は調製し直す。(アジ化ナトリウムによりPOD活性が阻害される。)
固定・パラフィン包埋過程での抗原のマスク・マスクされている可能性がある場合は、染色前に熱あるいはタンパク質分解酵素による抗原賦活化処理を検討してみる。
・賦活化処理(酵素・熱)が不十分、または過剰処理による分解も考えられるので最適な条件を十分検討する。
・熱処理後は緩衝液とともに組織切片を十分に冷却する。乾燥させない。
抗体や酵素反応が不十分・組織洗浄後の水分除去が不十分で、反応液が薄まっている可能性があるので水分を十分取り除く。
・抗体の濃度や反応時間の至適条件を検討する。特に一次抗体反応は確実に行う。
標本中に存在する抗原が少ない・一次抗体反応を4℃で一晩反応させるなど、インキュベーション時間を長くする。
・増感あるいは高感度検出系の二次抗体を使用する。
抗体・標識二次抗体・発色基質などの劣化・抗体は1回に使用する量を小分け分注し、凍結融解を繰り返さないようにする。
・標識二次抗体と発色基質の活性をチェックする。
・試薬の有効期限、保存方法を確認する。
Q2 バックグラウンドが高い。
A2 以下の対策が考えられます。
原因 対策
脱パラフィンが不完全・パラフィンが残っていると、非特異的な結合が起こるので、確実にパラフィンを除く。
洗浄が不十分・洗浄回数を増やす。
・洗浄液に非イオン性界面活性剤(Tween20 など)を加える。
内在性のペルオキシダーゼの存在・組織中のペルオキシダーゼを不活性化する(0.3%過酸化水素含有メタノールによる処理)。
非特異的結合・一次抗体反応の前に標識二次抗体の動物種と同じ動物血清(10%ヤギまたはウサギ正常血清など)でブロッキングする。
・BSAやカゼインなどのブロッキング試薬を使用する。
標識二次抗体の交差反応・組織と同じ動物種の免疫グロブリンまたは血清で吸収済みの二次抗体を選択する。
・マウス組織でマウス抗体を使用できるTaKaRa POD Conjugate Set Anti Mouse, For Mouse Tissue(製品コード MK200)を試してみる。
抗体の至適条件でない・抗体濃度を下げる。検出系によっては、データシートに記載されている濃度では高すぎる場合がある。
・0.1%BSAやカゼインなどブロッキング剤を含んだPBSで一次抗体を希釈して至適条件を検討する。
発色基質の反応時間が長い・顕微鏡で観察しながら、反応時間を定める。
室温が高い・常温(15~25℃)で行う。
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