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PicoPLEX® DNA-seq Kit Q&A

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Q1 PicoPLEX DNA-seq Kitはどのような用途に使用できるか?
A1  本キットはシングルセルからゲノムDNAを増幅し、イルミナNGSで染色体異数性とコピー数多型(CNV)を信頼性高く検出するために使用されます。割球と栄養外胚葉細胞を用いた染色体異数性解析や、癌研究における循環腫瘍細胞(CTC)の染色体異常分析などの用途にも使用可能です。
Q2 PicoPLEX DNA-seq Kitで使用できるサンプルは?
A2  以下のサンプルが使用可能です。
・哺乳類細胞 1~10 cells
・ゲノムDNA(6~60 pg ヒトDNA)
・ソートした染色体
Q3 PicoPLEX DNA-seq Kitの特長は何か?
A3  本キットは、シングルセルから再現性の高いDNA増幅が可能で、コピー数多型(CNV)等の染色体異常の研究のために、低カバレッジシーケンス用のNGSライブラリーを調製できます。
Q4  PicoPLEX DNA-seq Kitの所要時間は?
A4  本キットは、細胞の溶解からDNAの増幅・インデックス付加まで3時間以内で完了し、NGS用ライブラリーを調製することができます。
Q5 PicoPLEX DNA-seq Kitでうまく調製できた細胞の種類は?
A5  シングルセルの割球、栄養外胚葉細胞、および培養細胞で使用した実績があります。
Q6  PicoPLEX DNA-seq Kitに適した細胞の回収方法は?
A6  ソーティング、希釈、およびマイクロマニピュレーションで回収した細胞が使用できます。
Q7 細胞回収後に細胞を洗浄する必要があるか?
A7  はい、細胞外のDNAや増殖培地の混入を最小限に抑えるために、細胞は洗浄する必要があります。PBS(Ca、Mg およびBSAフリー)で洗浄し、洗浄バッファーの持ち込みは2.5 μl以下にすることを推奨します。
Q8 PicoPLEX DNA-seq Kitのサンプルインプット量は?
A8  本キットのサンプルのインプット量は、1反応あたり5 μlです。(細胞およびバッファーの持ち込み量は2.5 μlです)。細胞が1× PBS中に懸濁されている場合は、インプット量は2.5 μl以下にしてください。
Q9 ソーティングを行う場合に注意する点はあるか?
A9  はい、細胞を固定しないことと、サンプルの分取・回収に光散乱または位相差を使用することを強く推奨します。うまく分取された細胞の顕微鏡/目視確認を行うことにより、分取条件を最適化することができます。
Q10 抗体により染色した細胞は使えるか?
A10  はい、表面抗原抗体により染色した細胞は、細胞を固定していなければ使用できます。
Q11 インデックスを別途購入する必要があるか?
A11  いいえ、インデックスは96ウェルプレートに分注されたものがキットに含まれています。
Q12 シーケンスリード解析のために何塩基をトリミングする必要があるか?
A12  各リードの最初の11サイクルは、PicoPLEX DNA-seqライブラリー調製中に導入されたランダム塩基を含みます。解析には、各リードの最初の14塩基分をトリミングするか、15番目の塩基からキャリブレーションおよびデータ収集を開始してください。
Q13 PicoPLEX DNA-seq Kitは、Ion TorrentまたはPacBioのプラットフォームで使用できるか?
A13  いいえ、Ion TorrentやPacBioとは互換性はありません。
Q14 シングルリードとペアエンドの両方に対応したサンプルを調製できるか??
A14  はい、PicoPLEX DNA-seqを用いて作製したライブラリーは、イルミナNGSのシングルリードとペアエンドのいずれのシーケンスにも対応しています。
Q15 自分で設計したインデックスは使用できるか?
A15  いいえ、キットに含まれるインデックスは、他のインデックスで置き換えることはできません。
Q16 PicoPLEX DNA-Seq Kitを用いて作製したライブラリーのフラグメントサイズはどのくらいの範囲か?
A16  本キットを用いて作製されたライブラリーは、フラグメントのサイズ分布範囲が広く、通常約300~1,000 bp(インサートサイズ約200~900 bp)の範囲です。
Q17 PicoPLEX DNA-seq Kitの保存条件は?
A17  -20℃で保存してください。
Q18 PicoPLEX DNA-seqはどのサーマルサイクラーでも使えますか?
A18  50 μlの反応容量に対応できる、ヒートリッド型のサーマルサイクラーをご使用ください。インキュベーションとサイクリング中にサンプルが蒸発するのを避けるため、蓋の温度は100~105℃に設定してください。
Q19 PicoPLEX DNA-seq KitはリアルタイムPCR装置なしで使用できるか?
A19  はい、リアルタイムPCR装置は、反応液に蛍光色素(キットには含まれていない)を添加することによって増幅をモニタリングするために使用します。通常のサーマルサイクラーを使用する場合は、色素を添加する必要はなく、代わりに適切な量のヌクレアーゼフリー水を添加して反応液量を調整してください。ライブラリー増幅は、ライブラリーの一部を使用してゲルまたはBioanalyzerによって確認することができます。
Q20 リアルタイムPCR装置を使用した増幅のモニタリングに推奨される蛍光色素は?
A20  EvaGreen dye(Biotium Inc. Code.31000-T、20× EvaGreen dye in water)は、高感度で増幅反応への影響も少ないので推奨されています。使用するリアルタイム機器によっては、校正用のdyeも必要な場合があります。詳細はリアルタイムPCR装置のユーザーマニュアルをご参照ください。
Q21 プールされた精製ライブラリーの定量方法は?
A21  Library Quantification Kit(製品コード 638324)などのイルミナ用ライブラリー定量キットを使用して、リアルタイムPCRによりPicoPLEX DNA-seqライブラリーを定量してください。プールした精製ライブラリーは、50,000~500,000倍に希釈し、リアルタイムPCRの鋳型として使用します。ライブラリー濃度計算には、サイズを300 bpとして使用することを推奨します。
Q22 PicoPLEX DNA-seq Kitで調製したライブラリーの精製にAMPure XPビーズを使用する際、ビーズの割合は?
A22  CNV検出の目的のためには、ビーズ:サンプルを1:1の比で混合してください。
Q23 96ウェルプレート中の各インデックスペアの量はどれくらいか?
A23  各ウェルには、1回の使用に十分な量のデュアルインデックスの組み合わせが含まれており、ハイスループットにも使用できます。このプレートは、穴をあけることが可能なホイルで密封されています。マルチチャンネルピペットを使用して、ホイルに穴をあけて、反応に必要な量のデュアルインデックスを回収してください。
Q24 シングルセルからの全ゲノムde novoシーケンスにこのキットを使用できるか?
A24  いいえ、本キットは、コピー数多型(CNV)やその他の染色体異常の検出を目的とした低カバレッジシーケンス解析用で、シングルセルからの再現性の高いDNA増幅を提供します。このキットは、de novoシーケンスおよびリシーケンス等、高カバレッジのディープシーケンスには適していません。
Q25 PicoPLEX DNA-seq Kitはシングルインデックスまたはデュアルインデックスを使用しているか?
A25  本キットは、デュアルインデックス(8塩基)を使用しており、i5側インデックスとi7側インデックスの混合ミスを防ぐために、予め48通りに混合されています。インデックス試薬は使い切りの96ウェルプレートに分注されています。
Q26 MiSeqフローセルにどれくらいの濃度のPicoPLEX DNA-seqライブラリーをロードすればよいか?
A26  クラスター形成に関してはイルミナのフローセルに最適なクラスター密度になるように、クラスタリングに使用するDNA濃度を適切に調整することが重要です。
本キットを用いてシングルセルから作製されたライブラリーをMiSeq Reagent Kit v3で解析する場合、ライブラリーのサイズを300 bpとして、ロードするDNA濃度を16 pMから始めるのがよいでしょう。
Q27 MiSeqのフローセルにロードする前に、PhiXをライブラリーにスパイクすることは推奨されているか?
A27  最適な多様性を達成するために、フローセルにロードする前に、ライブラリーに少なくとも5%のPhiX DNAを添加することが重要です。
Q28 PicoPLEX DNA-seqはGCリッチ領域をカバーするか?
A28  GC領域のカバレッジ:リードの90%以上は25~70%GCに入ります。

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