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SMARTer® PicoPLEX® Gold Sigle Cell DNA-Seq Kit Q&A

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Q1 SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitはどのような用途に使用できるか?
A1  SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq KitはシングルセルからゲノムDNAを増幅し、イルミナNGSで染色体異数性、コピー数多型(CNV)、一塩基変異(SNV)を信頼性高く検出するために使用できます。割球と栄養外胚葉細胞を用いた着床前診断(PGT)や、癌研究における循環腫瘍細胞(CTC)の染色体異常や変異分析などに使用できます。
Q2 SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitはシングルセルからの全ゲノムde novoシーケンスに使用できるか?
A2  いいえ。SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq KitはシングルセルからゲノムDNAを再現性良く増幅し、コピー数多型(CNV)、一塩基変異(SNV)、その他の染色体異常の検出を目的としています。このキットはde novoシーケンスおよびリシーケンス等の高カバレッジのディープシーケンスには適していません。
Q3 SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitの所要時間は?
A3  SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitは細胞の溶解からDNAの増幅・インデックス付加まで3時間以内でNGS用ライブラリーを調製できます。
Q4  SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitで調製できた細胞の種類は?
A4  シングルセルの割球、栄養外胚葉細胞、および培養細胞での使用実績があります。
Q5 細胞表面抗原抗体で染色した細胞は使えるか?
A5  はい。細胞を固定していなければ使用できます。
Q6  インデックスキットを別途購入する必要があるか?
A6  はい。SMARTer DNA Single Index、Unique Dual Index、HT Dual Indexキットが使用できます。
Q7 自分で設計したインデックスは使用できるか?
A7  いいえ。SMARTer DNA Single Index、Unique Dual Index、HT Dual Indexキットの使用を推奨しています。
Q8 SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitにはどのようなインデックスタイプがあるか?
A8  SMARTer DNA Single Index、Unique Dual Index、HT Dual Indexキットがあります。
Q9 シーケンスリード解析のために何塩基をトリミングする必要があるか?
A9  各リードの最初の11サイクルはSMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitライブラリー調製中に導入されたランダム塩基を含みます。解析には、各リードの最初の14塩基分をトリミングするか、15番目の塩基からキャリブレーションおよびデータ収集を開始してください。
Q10 SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq KitはIon TorrentやPacBioプラットフォームで使用可能か?
A10  いいえ。Ion TorrentやPacBioでは使用できません。
Q11 シングルリードとペアエンドの両方に対応したサンプルを調製できるか?
A11  はい。SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitライブラリーはイルミナシーケンサーのシングルリード、ペアエンドに対応しています。
Q12 SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitで作製されたライブラリーのフラグメントサイズの範囲は?
A12  SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitで作製されたライブラリーはフラグメントサイズの幅が広く、通常約300~1,000 bp(インサートサイズ約200~900 bp)の範囲です。
Q13 SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seqはどのサーマルサイクラーでも使えるか?
A13  SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitは50 μlの反応容量に対応した、ヒートリッド型のサーマルサイクラーをご使用ください。インキュベーションやサイクリング中のサンプルの蒸発するのを避けるため、蓋の温度は100~105℃に設定してください。
Q14 SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq KitはリアルタイムPCR装置なしで使用できるか?
A14  はい。リアルタイムPCR装置は、反応液に蛍光色素(キットには含まれていない)を添加することによって増幅をモニタリングするために使用します。通常のサーマルサイクラーを使用する場合は、色素を添加する必要はなく、代わりに適切な量のヌクレアーゼフリー水を添加して反応液量を調整してください。ライブラリーの増幅は、作製されたライブラリーの一部を使用してゲルまたはBioanalyzerで確認することができます。
Q15 リアルタイムPCR装置を使用した増幅のモニタリングに推奨される蛍光色素は?
A15  EvaGreen蛍光色素(Biotium社、Code No.31000、EvaGreen Dye、20×水溶液)は高感度で増幅反応への影響が少ないため適しています。使用するリアルタイム装置によっては、校正用の蛍光色素も必要な場合があります。詳細は使用するリアルタイム PCR 装置のユーザーマニュアルをご参照ください。
Q16 プールされた精製ライブラリーの定量方法は?
A16  Library Quantification KitなどのイルミナNGS用ライブラリー定量キットを使用して、リアルタイムPCRによりSMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seqライブラリーを定量してください。プールした精製ライブラリーは、50,000~500,000倍に希釈し、リアルタイムPCRの鋳型として使用します。ライブラリー濃度計算用のサイズとして300 bpを使用します。
Q17 フローセルにどれくらいの濃度のSMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seqライブラリーをロードすれば良いか?
A17 
 MiSeqNextSeq
Conversion factor800 bp800 bp
Concentration8~12 pM0.9~1.4 pM
Recommended PhiX15%20%
Q18 SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitで調製したライブラリーの精製にAMPure XPを使用する際、ビーズの割合は?
A18  ビーズ:サンプルを1:1の比で混合してください。
Q19 SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq KitはGCリッチ領域をカバーするか?
A19  SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kitで作製されたリードの90%以上は25~70%のGC領域になります。

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