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Mycoplasma-EXとBIOMYCのQ&A

Mycoplasma-EX のQ&A

Q1 Mycoplasma-EXで処理する際の培養細胞数はどのくらいか?
A1 取扱説明書に従い、増殖培地に溶解した5 mlのMycoplasma-EX (培地 4.5 ml+Mycoplasma EX 0.5 ml) を5 mlの細胞懸濁液に加えます。(T25フラスコ等で行います。)
推奨する細胞数は細胞の種類や使用するフラスコのサイズによって異なります。マイコプラズマは細胞の表面に存在することが多く、Mycoplasma-EXで処理する際には、最初に細胞をできるだけ薄い密度で播種した後、80~90%コンフルエントになるまで培養します。
例えば、継代の際の推奨のスプリットが1:6~1:10の細胞の場合は、1:10で播種し、推奨播種密度が5,000~10,000 cells/cm2の細胞の場合は、5,000 cells/cm2で播種します。
(例えば、HEK293細胞であれば、推奨播種密度は通常2,000~6,000 cells/cm2になるので、処理する際には2,000 cells/cm2で播種することをお勧めします。)
Q2 処理した後もマイコプラズマが検出されますが、どうしたらよいか?
A2 Mycoplasma-EXはマイコプラズマを溶解する性質があるため、遊離のマイコプラズマDNAは処理後も上清中に残りますが、適切な細胞密度で連続的に培養することで、細胞外のDNaseにより遊離したDNAを分解します。よって、Mycoplasma-EX処理後は、十分に細胞密度の高い状態で4継代培養後にマイコプラズマの残留の有無を調べてください。なお、様々な要因によってMycoplasma-EXの処理能力が低下する場合がありますので、下記の内容を参考にしてください。
  • 主な要因はFCSの濃度です。FSCはコレステロールやMycoplasma-EXのターゲットとなる分子を含みます。そのため、培養液中でFCSの濃度が5%より高くならないようにしてください。(終濃度は5%にするようにしてください。)
  • 細胞の濃度も影響します。最初の処理でマイコプラズマを排除できなかった場合は、細胞濃度を低くしてください。またはMycoplasma-EXとのインキュベーション時間を長くしてください。
  • 細胞懸濁液に細胞の塊があることも影響します。処理する前にはトリプシン処理などを行って細胞の塊がないようにしてください。
  • マイコプラズマのタイターが高い場合、Mycoplasma-EXで2回の処理が必要です。その場合、最初の処理後に細胞が十分回復する時間が必要です。2日間は顕微鏡で細胞を観察してください。
Q3 Mycoplasma-EXの処理が細胞に有害になった場合は?
A3 取扱説明書の通りにMycoplasma-EXと細胞懸濁液のMixtureが正しく作製されなかった結果、Mycoplasma-EXが細胞に傷害性を持つ場合があります。処理中には細胞の様子を定期的に観察し、細胞傷害の影響がでた場合には、処理を中断してください。Mycoplasma-EXに感受性のあることが知られている細胞では、接着細胞で30分、浮遊細胞で15分ほど処理時間を短くしてください。
Q4 処理する細胞濃度を増やすことはできるか?
A4 細胞濃度を10倍まで増やすことはできますが、期待する除去効果が得られない場合があります。
Q5 Mycoplasma-EX処理後、マイコプラズマが完全に除去されたことはいつどのように確認できるか?
A5 処理後にマイコプラズマが生存した場合、それらは4継代後に検出可能なタイターまでに増殖します。4継代まで培養し、PCRキット等で確認をしてください。
Q6 Mycoplasma-EXでウイルスストックを処理することはできるか?
A6 細胞に感染する前のウイルスストックでは以下のように処理することができる。
  • Initial treatment reagentを希釈します(500 μlの試薬に4.5 mlの培地を加える)
  • 5 mlのウイルスストックを希釈した試薬に添加する
  • エンベロープをもつウイルスの場合、30分で処理を終了する。
  • 宿主細胞に感染し、培地を交換する。
  • 取扱説明書に従って連続的に処理を行う。
Q7 Mycoplasma-EXとBIOMYCの違いは何か?
A7 Mycoplasma-EXは抗生物質と非抗生物質を組み合わせて除去を行う試薬です。
まずInitial Treatment Reagent(生物系試薬)で直接マイコプラズマの膜を壊します。その後、Succession Treatment Reagent(抗生物質)は最初の処理で残ったマイコプラズマを除去する働きがあります。

BIOMYCはマイコプラズマに対する抗生物質で、複数回の処理で除去する試薬です。BIOMYC-1で4日間、BIOMYC-2で3日間処理し、必要に応じてこれを2~3回繰り返します。
BIOMYC-3を使用する場合、2~3日おきににBIOMYC-3を加えた培地で交換し、14日間培養します。
BIOMYCによる処理は日数がかかりますが、低コストで処理できる。
Q8 Mycoplasma-EXやBIOMYCでマイコプラズマを除去した細胞を凍結保存すると、完全にマイコプラズマは除去されているか?または再び活性化することはあるか?
A8 マイコプラズマ処理後、抗生物質を含まない培地で10~14日間培養し、マイコプラズマ検出試験を行うことを推奨します。もし、マイコプラズマが完全に除去されているなら(PCRテストで検出されないなら)、細胞の凍結融解によりマイコプラズマが再活性化することはありません。

BIOMYCのQ&A

Q1 BIOMYCはどのような試薬か?どのような効果があるか?
A1 BIOMYCは一般的に細胞に有害ではない既知の抗生物質をベースとした試薬です。BIOMYC-1はチアムリン、BIOMYC-2はミノサイクリン(テトラサイクリンを改良した誘導体)です。これらを組み合わせて処理を行うことで85%の効果があります。
BIOMYC-3はシプロフロキサン(DNA Gyfaseの合成阻害)で、2~3日おきにBIOMYC-3を加えた培地を交換し、14日間続けます。
処理後、10日間は抗生物質なしで培養し、PCR検出キットでの確認をお勧めします。
Q2 BIOMYCはどのように使用したらよいか?
A2 BIOMYC-1,-2を使用する場合
  • 1 mlのBIOMYC-1を100 mlの培地に加え、この培地溶液中でコンタミした細胞を4日間維持培養します。
  • 培地を吸引し、1 mlのBIOMYC-2を100 mlの新鮮培地に加え、この培地溶液中3日間細胞を維持します。
  • 上記の処理を2-3回繰り返します。
BIOMYC-3を使用する場合
  • 1 mlのBIOMYC-3を100 mlの培地に加えます。
  • 2~3日おきにBIOMYC-3を加えた培地を交換し、これを14日間続けます。
Q3 BIOMYCに感受性が高いマイコプラズマ株は何か?
A3 BIOMYC-1はチアムリン、BIOMYC-2はミノサイクリン(テトラサイクリンを改良した誘導体)です。マイコプラズマ感染の90%を占めるAcholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma hyorhinis, and Mycoplasma orale (Schmidt and Erfle; Exp Cell Res. 1984 Jun;152(2):565-570) に対して効果があります。
BIOMYC-3はシプロフロキサン(DNA Gyfaseの合成阻害)で、A. laidlawii, M. orale, M. hyorhinis, M. fermentans and M. argininiなどのマイコプラズマに効果があります。
Q4 Mycoplasma-EXやBIOMYCでマイコプラズマを除去した細胞を凍結保存すると、完全にマイコプラズマは除去されているか?または再び活性化することはあるか?
A4 マイコプラズマ処理後、抗生物質を含まない培地で10~14日間培養し、マイコプラズマ検出試験を行うことを推奨します。もし、マイコプラズマが完全に除去されているなら(PCRテストで検出されないなら)、細胞の凍結融解によりマイコプラズマが再活性化することはありません。
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