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Q&A

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TransIT-VirusGEN® SELECT Reagent Q&A

◆一般的質問
Q1 TransIT-VirusGEN SELECT Reagentの組成は?
A1 組成は非公開です。動物由来成分は含まれていません。

Q2 TransIT-VirusGEN Transfection ReagentとTransIT-VirusGEN SELECT Transfection Reagentの違いは?
A2 TransIT-VirusGEN SELECT Transfection Reagentは研究用試薬TransIT-VirusGEN Transfection Reagentと同じ様式により調製されていますが、バイオ医薬品用ウイルス製造用の調製試薬として適合させるための追加の品質検定が行われています。TransIT-VirusGEN Transfection Reagentの品質試験に加えて、無菌性、低エンドトキシン、マイコプラズマ不含のテストが追加されています。

Q3 TransIT-VirusGEN SELECT Transfection Reagentの保証期限は?
A3 適切に保存した場合、受け取り後6ヵ月です。

Q4 保存方法は?
A4 -30~-10℃で保存し、使用前に室温に戻し、静かに撹拌します。

Q5 接着性や浮遊性のHEK293細胞を使用してレンチウイルスやAAVを作製できるか?
A5 はい。TransIT-VirusGEN SELECT Transfection Reagentは、血清を含む接着培養や無血清での浮遊培養の293由来細胞を用いて高タイターのレンチウイルスやAAVを作製できます。使用293細胞を最適の培養条件で培養することにより、本製品で最適なウイルス産生の結果が得られます。

Q6 本製品により、どの程度のレンチウイルスのタイターが得られるか?
A6 得られるウイルス量は、HEK293細胞のサブタイプ、パッケージングシステム、ウイルスベクターによって大きく違ってきます。

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◆プロトコールについて
Q7 TransIT-VirusGEN SELECT ReagentとDNAの混合物を作製する時、どの無血清培地を使用すれば良いか?
A7 TransIT-VirusGEN SELECT ReagentとDNAの混合物を調製される時、Phosphate Buffered Saline (PBS) without calcium or magnesiumの使用を最もお勧めします。Opti-MEM I Reduced-Serum Mediumのような無血清培地も使用いただけます。heparinやpolydextran sulfateのようなポリアニオンを含む無血清培地の使用は、トランスフェクション効率を下げる可能性があります。

Q8 レンチウイルス作製で、TransIT-VirusGEN SELECT ReagentとDNA(パッケージングプラスミドとウイルスプラスミド)の使用量は?
A8 使用する培養容器のサイズによって異なるため、マニュアルのTable 3と4を参照してください。例えば、T75フラスコでは、45 μl TransIT-VirusGEN SELECT Reagentと15 μg 全DNA (7.5 μg transfer plasmid+7.5 μl Packaging Mix)となり、3:1 (μl reagent/μg DNA, vol:wt)の比率になります。

Q9 レンチウイルス作製で、ウイルスベクターとパッケージングプラスミドの推奨比率は?
A9 TransIT-VirusGEN SELECT Reagentは、プレミックスのパッケージングベクターの使用で最適化されています。プレミックスでない場合、4 μg gag-pol vector、1 μg rev vector、1 μg VSV-G vectorの比率で、等量(6 μg、パッケージングベクターとの比が1:1)のウイルスベクターと混合します。

Q10 AAV作製で、TransIT-VirusGEN SELECT ReagentとDNA (rep/capとpHelperとウイルスプラスミド)の使用量は?
A10 使用する培養容器のサイズによって異なるため、マニュアルのTable 1と2を参照してください。例えば、T75フラスコでは、45 μl TransIT-VirusGEN SELECT Reagentと22.5 μg 全DNAとなり、2:1 (μl reagent/μg DNA, vol:wt)の比率になります。

Q11 AAV作製で、推奨のプラスミド比率は?
A11 pAAV-hrGFPとpAAV-RCとpHelper (AAV Helper-Free System, Agilent Technologies)では、1:1:1(重量比)です。

Q12 プロトコールに記載のないサイズの培養容器でのトランスフェクション条件は?
A12 浮遊培養293細胞では、マニュアルの培養Table4に従って培養液量から試薬の使用量を算出して使用します。
接着培養293T細胞では、培養面積に従ってTransIT-VirusGEN SELECT Reagentと全DNAと無血清培地の混合物を調製します。AAV作製では、培養面積cm2当り0.02 ml PBS+0.3 μg 全DNA+0.6 μl TransIT-VirusGEN SELECT Reagentとなり、レンチウイルス作製では、培養面積cm2当り0.02 ml PBS+0.2 μg全DNA+0.6 μl TransIT-VirusGEN SELECT Reagentです。

Q13 抗生物質はトランスフェクションに影響するか?
A13 塩基性抗生物質はトランスフェクション複合体の形成を阻害しますので、試薬/DNA複合体の形成時には抗生物質を除くことをお勧めします。複合体形成後は、低濃度(0.1~1倍)の抗生物質を含む培地で培養されている細胞へ添加できます。

Q14 トランスフェクション後、培地交換は必要か?
A14 いいえ。トランスフェクション後の培地交換はお勧めしていません。レンチウイルスやAAVのタイターが下がる可能性があります。

Q15 細胞密度や細胞継代数はトランスフェクションに影響するか?
A15 はい。接着培養293T細胞では、形質転換時に80~95%コンフルエントであることが重要です。80%以下のコンフルエントでトランスフェクションした場合、細胞毒性が高くなり、ウイルス産生が低下します。細胞継代数が高くなると、細胞形態や分裂速度などの細胞特性が変化しますので、細胞継代数を確認することも重要です。レンチウイルス産生には、HEK293T/17細胞の場合、30継代以下のものを使用してください。
浮遊培養293細胞では、2×106細胞/mlが推奨細胞濃度です。トランスフェクションの18~24時間前に細胞継代し、元気に細胞分裂している状態でトランスフェクションしてください。

Q16 トランスフェクション後、レンチウイルスはいつ回収すれば良いか?
A16 トランスフェクション後48時間が最適です。レンチウイルスは、48~72時間後の間も少量産生されます。

Q17 レンチウイルスのタイター測定法は?
A17 レンチウイルスのcapsidタンパクp24をELISAで測定する方法やHIV-1ゲノムの保存配列をqPCRで測定する方法が広く利用されています。TransIT-VirusGEN SELECT Transfection Reagentのプロトコールでは、GFP発現ウイルスとHEK293T/17細胞を使用した形質導入率から求められるタイター測定法を紹介しています。本法では、低いMOIで形質導入し、48時間後にGFP発現を測定しています。導入ユニット/ml (TU/ml)は以下の計算式で求めることができます。
Titer (Transducing Units/ml)=Number of target cells (Count at day 2, transduction)×[% GFP positive cells/100]
(Volume of Lentivirus Stock in ml)

Q18 トランスフェクション後、AAVはいつ回収すれば良いですか?
A18 トランスフェクション72時間後の回収で高いタイターのウイルスが得られます。

Q19 AAVのタイター測定法は?
A19 AAV粒子を測定するELISA法やウイルスゲノムを定量するqPCR法が広く利用されています。TransIT-VirusGEN SELECT Transfection Reagentのプロトコールでは、GFP発現ウイルスとHT1080細胞を使用した形質導入率から求められるタイター測定法を紹介しています。本法では、低いMOIで形質導入し、72時間後にGFP発現を測定しています。導入ユニット/ml (TU/ml)は以下の計算式で求めることができます。
Titer (HT1080 Transducing Units/ml)=Number of target cells (Count at day 2, transduction)×[% GFP positive cells/100]
(Volume of AAV Stock in ml)

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◆トラブルシューティング
Q20 ウイルスタイターを上げる方法は?
A20 以下の項目をご検討ください。
  • トランスフェクション時の細胞密度を最適化する。接着性293T細胞の推奨密度は、80~95%コンフルエントです。浮遊性293細胞では、2×106 cells/mlです。
  • TransIT-VirusGEN SELECT ReagentとDNAの比率は、レンチウイルス産生では、3 μl TransIT-VirusGEN SELECT Reagent:1 μg total DNA (transfer+packaging plasmids)で、AAV産生では、2 μl TransIT-VirusGEN SELECT Reagent:1 μg total DNAです。
  • プラスミドDNAの純度を上げたり、エンドトキシン等の不純物を低減してください。エンドトキシン(大腸菌由来lipopolysaccharide)は、MiraCLEAN Endotoxin Removal Kit(製品コード MIR5910/5900)を使用して除くことができます。
  • 本製品とDNAの複合体は、PBS(-/-)で作製し、血清を含む細胞培養培地中の細胞へ添加してください。(注:Opti-MEM I Reduced-Serum Mediumなどの無血清培地も複合体の作製時に使用できます)
  • プラスミドDNA量を上げてください。製品プロトコールのTable1-4を参考に推奨DNA量を使用します。
  • 製品プロトコールの「Troubleshooting Guide」もご参考ください。

Q21 TransIT-VirusGEN SELECT Transfection Reagentの細胞毒性は?
A21 AAVプラスミドをトランスフェクションしたHEK293T細胞での細胞形態の変化は、ウイルス産生に伴って起こることが予想されます。レンチウイルス作製でVSV-Gエンベロープが過剰発現した時に細胞形態変化や細胞間の融合が起こりますが、ウイルスタイター量には影響しません。しかし、ウイルスタイターに影響する細胞毒性は、トランスフェクションが適切に行われなかった時に見られるかもしれません。
トランスフェクション後の細胞生存率を改善するために、以下をご参考ください。
  • トランスフェクション時の細胞密度(%コンフルエンス)が非常に低い。接着性293T細胞での推奨細胞密度は、80~95%です。細胞毒性が見られた時は、細胞密度を上げてください。
  • プラスミドDNAに高レベルのエンドトキシンが含まれる。トランスフェクションに使用するDNAは高純度、無菌的でエンドトキシンなどのコンタミの少ないものにしてください。MiraCLEAN Endotoxin Removal Kit(製品コード MIR5910/5900)を使用してエンドトキシン(lipopolysaccharide)を除くことができます。
  • 発現する目的遺伝子が細胞には毒性がある。発現目的遺伝子の細胞毒性を調べるために、ベクターのみをトランスフェクションした細胞での毒性を見てください。また、目的遺伝子が低発現でも良い場合、プラスミドDNA量を減らすこともできます。その時は、空のクローニングベクターなどをキャリアーDNAとして使用し、最適のTransIT-VirusGEN SELECT Reagent:DNA比を維持してください。例えば、0.5 μg transfer DNAと0.5 μg pUC18 と1 μg packaging plasmidで複合体を調製します。
  • TransIT-VirusGEN SELECT ReagentとDNAの複合体が均一に細胞上に播かれていない。複合体は全ての細胞に分布するように、均一に混合します。均一にするために、培養プレート等を前後左右に揺り動かしてください。培養面積が広いプレートを使用する場合、培養培地を抜き取り、それにTransIT-VirusGEN SELECT Reagent/DNAを混合した後、培養プレートへ戻してトランスフェクションすることができます。
  • 細胞形態が変化している。細胞継代数が多い場合や少ない場合、トランスフェクション試薬に感受性が高いことがあります。再現性を良くするために、できるだけ継代数を合せてください。
  • マイコプラズマに汚染されていると細胞生存率に影響します。マイコプラズマ汚染をチェックし、汚染されている場合は、適切な抗生物質等で除染してください。

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