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Protocols

制限酵素Genome DNA Analysis Grade

TaKaRa's QC Protocol
 (制限酵素Genome DNA Analysis Grade)

Bacterial Genome DNAの調製
  1. Bacteriaを20 mlのL-brothに植菌し、OD600=0.6になるまで培養する。
  2. 得られたcellをNT Bufferで洗菌し、NT Buffer 1.5 mlに懸濁する。
  3. 2.と等量の1%FMC InCert Agaroseを加え、インサートモールドに分注し、固める(アガロースゲルブロック)。
  4. 3.を5倍量のEC Solution(1 mg/ml Lysozymeおよび20 μg/ml RNase Aを含む)に浸し、37℃で一晩振とうする。
  5. 5倍量のES Solution(1 mg/ml Proteinase Kを含む)に移し、50℃で一晩振とうする。
  6. 5倍量のTE Bufferで1時間振とう洗浄後、さらに、5倍量のTE Buffer(1 mM PMSFを含む)に移し、43℃で4時間振とうする(2時間振とう後、さらに1 mM PMSFを加えている)。
  7. 5倍量のTE Bufferで数回洗浄し、4℃で保存する。
制限酵素反応
  1. ゲルブロックを10倍量の制限酵素反応Bufferに浸し、37℃、30分間、軽く振とうし、ゲルブロックをバッファライズする。
  2. バッファライズされたゲルブロックを2倍量の反応Bufferへ移し、適当量の制限酵素を加え、各酵素の条件で酵素反応を行う(関連情報「制限酵素Genome DNA Analysis Gradeについて」参照)。
  3. ゲルブロックを10倍量のES Solutionに移し、50℃、30分~1時間振とうし、制限酵素反応を停止する。
  4. 反応停止後、ゲルブロックを10倍量のTE Bufferで洗浄することが望ましい。
パルスフィールド電気泳動
各酵素・Genome DNAに適した泳動パターンを得るため、2通りの条件で泳動を行っている。泳動用のゲルにはSeaKem GTG Agarose、BufferはTris-Borate-EDTAを用いている。

電気泳動条件

対象酵素

A)Voltage  150V
  Pulse time 30sec
  Run time 40hrs
  Buffer temp 14℃
  Gel conc 1.2%
Aat II Bln I Bst 1107 I Cla I Cpo I  Dra I
Fse I Mun I Nhe I Not I Nsp V PshB I Psp 1406 I
Sac II Sfi I Sma I SnaB I Spe I
Sse8387 I Ssp I Xba I
B)Voltage 120V
  Pulse time 5sec
  Run time 40hrs
  Buffer temp 14℃
  Gel conc 1.0%
Aor51H I Avi II Bgl I BssH II Eco52 I  Mlu I
Nae I Nru I Pvu I Sal I Swa I
Xho I
培地・Buffer組成

L-broth

Trypton

10 g

Yeast ext.

5 g

NaCl

5 g

Glucose

1 g

H2O(pH7.2)

1 L


EC Solution

6 mM

Tris-HCl (pH7.6)

1 M

NaCl

0.1 M

EDTA (pH7.6)

0.5%

Brij-58

0.2%

Deoxycholate

0.5%

N-Lauroylsarcosine sodium salt

TE Buffer

10 mM

Tris-HCl (pH8.0)

1 mM

EDTA

NT Buffer

1 M

NaCl

10 mM

Tris-HCl (pH7.6)

ES Solution

500 mM

EDTA (pH9.0~9.5)

1%

Lauroylsarcosine

Tris-Borate-EDTA

90 mM

Tris-HCl(pH8.3)
90 mM Borate
2.5 mM EDTA
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