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Alkaline Phosphatase(BAP, CIAP)による脱リン酸化反応

Polynucleotide Kinaseにより核酸の5’末端を32Pで標識する際に、核酸の5’末端のリン酸をAlkaline Phosphataseであらかじめ除去しておくと、高い標識効率が得られる。また、異種DNAのクローニングの際にも、ベクター側の5’末端リン酸をAlkaline Phosphataseで処理しておくと、ベクターだけのセルフライゲーションが防げるため、形質転換細胞のバックグラウンドを下げることができる。
添付Bufferを用いる脱リン酸化反応
マイクロチューブ内で次の反応液を調製し、全量を50 μl にする。
DNA fragments(1~20 pmol)
滅菌精製水
10× Alkaline Phosphatase Buffer*1 5 μl
Bacterial Alkaline Phosphatase(5 U/μl) 1~2 μl*2
または
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(30 U/μl) 1~2 μl*2
  ↓
BAPの場合、37~65℃で30分間インキュベートする。
CIAPの場合は37℃で、30分または50℃で、30分間インキュベートする。または37℃で、15分インキュベートした後、50℃で、15分間インキュベートする。*3
  ↓
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出する(2回)。*4
  ↓
クロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)で抽出する。
  ↓
2.5 μlの3 M NaClを加える(終濃度150 mM)。
  ↓
エタノール沈殿(2.5倍量の冷エタノールを加え、-20℃で30~60分間保冷後、遠心分離)
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沈殿を200 μlの70%冷エタノールで洗浄後、乾燥
  ↓
TE Buffer(20 μl以下)に溶解

*1 10× Alkaline Phosphatase Buffer
500 mM Tris-HCl、pH9.0, 10 mM MgCl2
*2DNAの5’末端1 pmolあたり、BAP、CIAP共に0.01~0.1 Uは必要である。しかし、DNAが制限酵素で切断後、エタノール沈殿で精製されていないときは、完全分解に必要な酵素量はさらに1~2桁多くなる。
*3一本鎖や5’突出末端の核酸は弱い条件でも充分に脱リン酸化されるが、平滑末端や3’突出末端の場合は高い温度で処理する方がよい。特にBAPによるニック部分の脱リン酸化処理は65℃、30分で行うのが望ましい1)
*4BAPの場合は必ず2回おこなう必要がある。CIAPの場合は1回でもかまわない。
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