この画面を閉じる

Protocols

TaKaRa LA Taq®

LA PCRの際の鋳型DNAの調製例

TaKaRa LA Taq(製品コード RR002A)

鋳型DNAの状態は、LA PCRの正否に重要なファクターである。
10 kbを超える増幅反応を行う場合には、簡便な方法(例えばcellを熱処理あるいはprotease処理のみ)で調製したサンプルDNAは鋳型としては適さない。充分に精製した完全な形のDNA(nick等が入っていないもの)を使用することが望ましい。

(1)ヒトゲノムDNAの調製例
  1. 15枚のペトリ皿より、HL60細胞(1.5×109 cells)を収集し、0.7% NaClで2回洗浄する。
  2. 10 mM Tris-HCl(pH8.3)15 mlに細胞を懸濁する。
  3. 細胞懸濁液に、10 mg/ml Proteinase K 150 μlと10% SDS 150 μlを加え、60℃で1時間インキュベートした後、37℃で16時間インキュベートする。
  4. フェノール(1M Tris-HCl、pH8.0で飽和したもの)15 mlを加え、おだやかに15分間混合する。
  5. 9,000 rpm(約6,000×g)で10分間遠心分離する。
  6. 上清を別のチューブに移し、TE Buffer、pH9.0で飽和したフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)15 mlを加え、15分間おだやかに混合する。
  7. 9,000 rpm(約6,000×g)で10分間遠心分離する。
  8. 上清を別のチューブに移し、クロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)15 mlを加え、チューブを上下させながらおだやかに15分間混合する。
  9. 9,000 rpm(約6,000×g)で10分間遠心分離する。
  10. 上清を別のチューブに移し、3 M酢酸ナトリウム(pH5.2)1.5 mlとエタノール30 mlを加え、おだやかに混合する。
  11. 細いガラス棒でDNAを巻取り、回収する。
  12. 80%エタノールで洗浄し、乾燥する。
  13. DNAを10 mlのTE Bufferに溶解し(DNAを巻取ったガラス棒をBufferに入れ、4℃で一晩置いておく)、10 mg/ml RNaseA 100 μlを加え、37℃で1時間インキュベートする。
  14. フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)10 mlを加え、5分間おだやかに混合する。
  15. 9,000 rpm(約6,000×g)で10分間遠心分離する。
  16. 上清を別のチューブに移し、クロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)10 mlを加え、5分間おだやかに混合する。
  17. 9,000 rpm(約6,000×g)で5分間遠心分離する。
  18. 上清を別のチューブに移し、3 M酢酸ナトリウム(pH5.2)1 mlとエタノール20 mlを加えておだやかに混合する。
  19. 細いガラス棒でDNAを巻取り、回収する。
  20. 80%エタノールで洗浄し、乾燥する。
  21. 2 mlのTE Bufferに溶解し(DNAを巻取ったガラス棒をBufferに入れ、4℃で一晩置いておく)、最終濃度0.5 mg/mlに調整する。
(2)大腸菌ゲノムDNAの調製例
  1. 200 mlのLB培地で一晩培養した大腸菌の菌体をフラスコ(2 l)2本から遠心回収し、50 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH8.0、40 mlに懸濁する。
  2. -80℃で30分間凍結する。
  3. 0.25 M Tris-HCl(pH8.0)に10 mg/mlの濃度で溶解したリゾチーム溶液4 mlを加え、時々混合しながら室温にて溶解。溶解後、氷中に45分間置く。
  4. STEP〔0.5% SDS、50 mM Tris-HCl(pH8.0)、0.4 M EDTA、1 mg/ml Proteinase K〕8 mlを加え、50℃で1時間インキュベートする。
  5. TE Buffer〔10 mM Tris-HCl(pH8.3)、1 mM EDTA〕45 mlを加え、さらにTE Buffer pH9.0 で飽和したフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)96 mlを加え、チューブを上下し、5分間おだやかに混合する。
  6. 5,000 rpm(約4,000×g)で15分間遠心分離する。
  7. 上清を別のチューブに移し、クロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を96 ml加え、チューブを上下させながらおだやかに5分間混合する。
  8. 5,000 rpm(約4,000×g)で15分間遠心分離する。
  9. 上清を別のチューブに移し、3 M酢酸ナトリウム(pH5.2)9 mlとエタノール225 mlを加え、おだやかに混合する。
  10. 細いガラス棒でDNAを巻取り、回収する。
  11. 80%エタノールで洗浄し、乾燥する。
  12. DNAを20 mlのTE Bufferに溶解し(DNAを巻取ったガラス棒をBufferに入れ、4℃で一晩置いておく)、10 mg/ml RNaseA 10 μlを加え、37℃で30分間インキュベートする。
  13. 前述のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)20 mlを加え、チューブを上下し5分間おだやかに混合する。
  14. 10,000 rpm(約7,500×g)で15分間遠心分離する。
  15. 上清を別のチューブに移し、クロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)20 mlを加え、チューブを上下し5分間おだやかに混合する。
  16. 10,000 rpm(約7,500×g)で15分間遠心分離する。
  17. 上清を別のチューブに移し、3 M酢酸ナトリウム(pH5.2)2 mlとエタノール50 mlを加えておだやかに混合する。
  18. 細いガラス棒でDNAを巻取り、回収する。
  19. 80%エタノールで洗浄し、乾燥する。
  20. 20 mlのTE Bufferに溶解し(DNAを巻取ったガラス棒をBufferに入れ、4℃で一晩置いておく)、最終濃度0.1 mg/mlに調整する。
なお、TaKaRaではこの方法で調製したDNAをコントロールテンプレートとして販売していますのでご利用ください。(LA PCR用genome DNA Set:製品コード 9060)
■ 推奨DNA使用量
ヒトゲノムDNAの場合 0.1~1 μg
大腸菌ゲノムDNAの場合 10~100 ng
λファージDNAの場合 0.5~2.5 ng
この画面を閉じる