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Protocols

TaKaRa PCR Amplification Kit

Standard Protocol
 (TaKaRa PCR Amplification Kit)

[TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceを使用した場合]
A. コントロール反応
本キットには、コントロールとしてλDNAおよびλDNAの6,012 bpまたは500 bpのターゲットシーケンスを増幅するためのプライマーが含まれている
  1. 下記に示す反応液を調製する。
     液量終濃度
    10×PCR Buffer(Mg2+ plus)*5 μl[1×]
    dNTP Mixture4 μl各200 μM
    Control Primer1 0.5 μl0.2 μM
    Control Primer2 or 3 0.5 μl0.2 μM
    TaKaRa Taq 0.25 μl1.25 U/50 μl
    Control Template 0.5 μl0.5 ng/50 μl
    滅菌精製水 39.25 μl 
    Total 50 μl 

    * 必要に応じて10×PCR Buffer(Mg2+ free)およびMgCl2溶液をご使用ください。
  2. TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceの本体にセットする。
  3. 以下の条件を設定する。
    Control Primer 1、2を用いた場合(6,012 bpの増幅)
    94℃、1 min(denaturation)30 cycles
    68℃、4 min(annealing and extension)
    72℃、5 min1 cycle


    Control Primer 1、3を用いた場合(500 bpの増幅)
    94℃、30 sec(denaturation)25 cycles
    55℃、30 sec(annealing)
    72℃、30 sec(extension)
    72℃、2 min1 cycle


    以上の条件でControl Templateのターゲットシーケンスが増幅される。
B.一般の反応
基本的にはコントロール反応と同じ。
PCR反応はdenature, annealing extentionの3段階の温度変化を基本してるが、増幅鎖長が長い場合(>=6kb)には、annealingとextentionを兼ねた2段階の温度変化条件(シャトルPCR)の方が適している場合がある。
ただし、ターゲットシークエンスのサイズ、プライマーのサイズや塩基配列に応じたdenaturation、annealing、extension各ステップの最適条件(温度、時間)をプログラムして反応を行う必要がある。
C.電気泳動
反応終了後の溶液5~10 μlについて6×Loading Bufferを1/6量加え、アガロースゲルのスロットに注入し、電気泳動を行う。アガロースゲルの種類、濃度はDNAのサイズ、目的によって使い分ける。
電気泳動後のゲルを1μg/mlのエチジウムブロマイド水溶液もしくはSYBR Green I溶液(TBE bufferまたはTAE bufferで10,000倍希釈したもの)中に20~30分間放置、染色後紫外線照射のよってDNAのバンドを確認する。
操作上の注意
キットの内容物はvortexにて約2秒よく撹拌し、遠心後使用する。ただし、TaKaRa Taqはピペッティング操作で注意深くゆっくりと撹拌する。また各内容物は使用直前まで氷上で保存する。
サンプルDNA中にプロテアーゼのコンタミネーションの可能性がある場合は、最初の熱変性ステップ(denaturation step)の後でTaKaRa Taqを加えること。プロテアーゼは熱失活し、TaKaRa Taqの分解を防ぐことができる。
サンプルDNAの調製方法によっては10×PCR Buffer(Mg2+ plus)のMg2+濃度が至適でない場合がある。この場合は10×PCR Buffer(Mg2+ free)を用いてMg2+濃度を変えて予備実験し、至適Mg2+濃度を確認する必要がある。
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