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Protocols

pAUR224 DNA

酢酸リチウム法によるSchizo. pombeの形質転換法

pAUR224 DNA(製品コード 3603)


キット以外に必要な試薬
YEL medium 5 g Yeast extract, 30 g D-glucose/1 L water
YEA agar plate YEL mediumに2%のagarを加える
YEA selective medium ≧0.5 μg/ml AureobasidinA
MB medium(1 L当たり) 5 g glucose, 5 g (NH4)2SO4, 0.5 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4エ7H2O, 0.36 g CH3COOK, 0.1 g NaCl, 0.1 g CaCl2エ2H2O, 1 ml trace elements, 1 ml ビタミン溶液
Trace elements(100 ml当たり) 500 mg H3BO3, 40 mg CuSO4エ5H2O, 100 mg KI, 200 mg FeCl3エ6H2O, 530 mg MnSO4エ4H2O, 1,000 mg (NH4)6Mo7O24エ4H2O, 400 mg ZnSO4エ7H2O
ビタミン溶液(100 ml当たり) 1 g nicotinic acid, 1 g myo-inositol, 1 mg biotin, 100 mg pantothenic acid
0.1 M酢酸リチウム(pH4.9) 酢酸によりpHを4.9に調整後、ろ過滅菌
50%(w/v)PEG4000 ろ過滅菌
操作手順

  1. 100 ml MB培地中で酵母を30℃で培養し、OD600= 0.2~0.5まで培養する(約15時間)。
  2. 2,000 rpm、5分間の遠心により菌体を回収する。
  3. 菌体を滅菌水で洗う。
  4. 50 OD600ユニット相当の菌体当たり0.8 mlの0.1 M酢酸リチウムを加え、細胞を懸濁する。
  5. マイクロ遠心チューブに細胞懸濁液100 μlを分注し、30℃で1時間インキュベートする。
  6. プラスミドDNAを 10 μl(約1 μg)加える。
  7. 290 μlの50% PEG4000(30℃保温)を加え、ゆるやかに懸濁する。
  8. 30℃で1時間インキュベートした後、43℃で15分間インキュベートする。
  9. 室温で5分間静置する。
  10. 5,000 rpmで2分間遠心後、上清を完全に除く。
  11. 菌体を5 mlのYEL培地に懸濁した後、30℃で6時間以上培養する。
  12. 一部をYEA選択培地プレートに播く。


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