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Protocols

Westase(酵母細胞壁溶解酵素)

Westase™を用いた酵母からのゲノムDNA抽出精製プロトコール


【試薬】

  ・SEC   0.4 M Sodium tartrate
100 mM EDTA
10 mM Citrate phosphate, pH6.0
  ・EDTA溶液   10 mM Tris-HCl, pH7.5
100 mM EDTA
  ・TE-1   50 mM Tris-HCl, pH7.5
20 mM EDTA
  ・TE-2   10 mM Tris-HCl, pH8.0
1 mM EDTA
  ・Westase溶液   10 mg/ml SEC
  ・Proteinase K溶液   10 mg/ml TE-1
  ・RNase A溶液   1 mg/ml TE-2
  ・10% SDS

【手順】
  1. 酵母をYPD培地で対数増殖期後期まで培養し、集菌、洗浄する。
  2. 菌体(培養液200または400 ml相当)を5 mlのSECに懸濁した後、5 mlのWestase溶液を加え、ゆっくり振盪しながら37℃で15~40分間反応する。
  3. 2,500 rpmで10分間遠心して集菌する。
  4. 5 mlのSECに穏やかに懸濁し、2,500 rpmで10分間遠心して集菌する。
  5. 4 mlのTE-1に懸濁し、0.5 mlのProteinase K溶液、0.5 mlの10% SDSを加えて37℃で40分間反応する。
  6. 5 mlのフェノール/クロロホルム(1:1)を加えて室温で40分間ゆっくりと混合する。
  7. 室温、3,000 rpmで10分間遠心する。
  8. 上層(水層)を新しいチューブに移す。
  9. 100% 冷エタノールを2倍量加えて穏やかに混合し、生成した糸状のDNAをガラス棒で巻き取る。巻き取れない場合は、遠心して沈殿として回収し、70% 冷エタノールで洗浄する。
  10. DNAを2 mlのEDTA溶液に完全に溶解した後、40 μlのRNase A溶液を加えて37℃で2時間反応する。
  11. フェノール/クロロホルム抽出を2回行った後、クロロホルム抽出を1回行う。
  12. 9.の操作を行う。
  13. 0.5~1.0 mlのTE-2に溶解する。
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